3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.4. Tình hình dịch cúm gia cầm tại huyện Quảng Ninh
Huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình có vị trí địa lý từ: 17013’59” B và 106033’ 00” Đ. Huyện có 4 dạng địa hình chính, gồm: vùng núi cao, vùng đồi trung du, vùng đồng bằng và vùng cồn cát ven biển, có địa hình phía Tây là núi cao và thấp dần từ Tây sang Đông với khí hậu đặc trưng của chế độ Nhiệt đới gió mùa 1 năm được chia làm 2 màu rõ rệt (mùa mưa và mùa khô). Nhiệt độ trung bình năm là 24,6oC với lượng mưa hàng năm cao dao động trong khoảng 1.448mm - 3.000mm tập trung vào các tháng 9,10,11. Nhiều năm về mùa mưa thường có lũ lụt trên diện rộng và bão lốc; mùa khô nắng gắt có gió Tây Nam khô nóng lượng nước bốc hơi lớn đạt 200mm/tháng, độ ẩm không khí thấp, gây hạn hán nghiêm trọng, với điều kiện tự nhiên tương đối khắc nghiệt, các bệnh truyền nhiễm ở gia súc, gia cầm hay xảy ra. Trong mấy năm gần đây nhờ được sự quan tâm của chính quyền các cấp và thực hiện tốt công tác tiêm phòng định kỳ hàng năm, cũng như tăng cường công tác tuyên truyền nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi về phòng chống dịch bệnh và đặc biệt Chi cục Chăn nuôi và Thú y luôn chú ý đến công tác tập huấn nâng cao kiến thức chuyên môn cho đội ngũ cán bộ thú y, nhất là đào tạo mạng lưới thú y phường, xã. Do đó, công tác thú y trong thời gian qua đã có nhiều chuyển biến và hạn chế được sự phát sinh dịch bệnh ở gia súc, gia cầm. Tuy vậy dịch bệnh cúm gia cầm vẫn là mối đe dọa thường xuyên đối với bà con nông dân.
Ngày 17/7/2012, UBND tỉnh Quảng Bình ban hành quyết định công bố dịch trên địa bàn xã An Ninh huyện Quảng Ninh, dịch cúm làm 13.473 gia cầm bị ốm và tiêu hủy do các xã của huyện gồm xã Vạn Ninh, An Ninh, Gia Ninh và Tân Ninh có chung một cánh đồng rộng lớn với các xã của huyện Lệ Thủy gọi là địa danh Hói Sỏi (xã này thuê đất của xã khác để trồng lúa và chăn thả gia cầm (khi xong vụ mùa) do đó nguy cơ bị dịch bệnh rất cao. Từ năm 2013 đến 2017 không xảy ra dịch cúm gia cầm trên địa bàn huyện Quảng Ninh.
Bảng 1.4. Tình hình dịch bệnh cúm gia cầm từ năm 2012 - 2017 Năm Xã Hộ Gia cầm bị mắc bệnh Tổng số gia cầm Tỷ lệ 2012 4 19 13.473 275.684 4,887 2013 0 0 0 282.753 0 2014 0 0 0 321.801 0 2015 0 0 0 330.957 0 2016 0 0 0 386.156 0 2017 0 0 0 399.772 0
(Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình, 2017)
1.4. Vi rút học bệnh cúm gia cầm
1.4.1. Cấu trúc của vi rút cúm gia cầm
Vi rút cúm gia cầm có tên khoa học là Avian Influenza Virút, thuộc họ
Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (basic taxomomy). Hình thái và
cấu trúc vi rút cúm gia cầm đã được Kawaoka and Murphy (1988) mô tả qua kính hiển vi, vi rút cúm A có hình cầu hoặc hình khối kéo dài, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi kéo dài đến vài µm. Phân tử lượng của hạt vi rút có khối lượng khoảng từ 250 triệu Dalton. Vi rút có cấu tạo đơngiản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand.
Hình 1.1. Hình thái và cấu trúc vi rút cúm gia cầm
(Nguồn: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html)
Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút , bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ lớp màng tương bào của tế bào vật chủ bị nhiễm và trở thành 1 phần của hạt vi rút trong quá trình hình thành. Trên bề mặt có các gai protein (gai mấu) nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ vi rút có bản chất cấu tạo là các glycoprotein gồm: HA có hoạt tính ngưng kết tố hồng cầu, NA và MA (Matrix) và các dấu ấn khác của vi rút (Bender et al, 1999; Zhao et al, 2008)
Bên cạnh đó, trong thành phần áo ngoài còn có một số ít lỗ hổng (pore) cấu tạo từ protein M2. Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ vi rút, mã hóa cho 11 protein tương ứng của vi rút, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 (Ito et al, 1998; Conenello et al, 2007). Về danh pháp, nhóm vi rút cúm A được phân chia thành nhiều phân typ (subtyp), các phân typ này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các chủng vi rút ở cơ thể bị nhiễm. Có 16 phân typ HA và 9 phân typ NA đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân typ này, về lí thuyết, có thể tạo ra hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotyp - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí phân lập-Số hiệu đăng kí chủng vi rút - Thời gian phân lập -
Loại hình phân typ [HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1). Đối với các vi rút được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) (WHO/OIE/FAO, 2008).
1.4.2. Đặc điểm cấu trúc hệ gence cúm gia cầm
Hệ gen vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 - 8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa cho 11 protein khác nhau của vi rút. Mỗi phân đoạn RNA của vi rút cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) - bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzyme polymerase (PA, PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của vi rút. Các phân đoạn của hệ gen vi rút cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000 - 15.000 bp (tuỳ theo từng chủng vi rút cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kilobase thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ vi rút. Hai đầu 5’- và 3’- sợi RNA hệ gen vi rút có gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các phân typ là: 5’-AGUAGAACAAGG… và 3’- UCG(U/C)UUUCGUCC.
Hình 1.2. Các hệ gen vi rút cúm
Các phân đoạn gen của vi rút cúm A/H5N1
Các phân đoạn 1,2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của vi rút, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, bao gồm:
- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của vi rút, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA vi rút. Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (Murphy and Webster, 1996).
- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme polymerase trong quá trình tổng hợp RNA vi rút , chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy and Webster, 1996).
- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2.233bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83.000 Da, là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của vi rút. PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiễm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của vi rút (Luong and Palese, 1992).
Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của vi rút, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng vi rút cúm A, bao gồm:
- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng vi rút cúm A. Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt vi rút cúm, gồm hai tiểu phần HA1 và HA2. Vùng nối giữ HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzyme protease, và đây là vùng quyết định độc lực của vi rút (Bosch et al., 1981;
Gambotto et al., 2008).
- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của vi rút, có chiều dài thay đổi theo từng chủng vi rút cúm A. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của vi rút, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 50.000 Da. Các nghiên cứu phân tử gen NA của vi rút cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng vi rút cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của vi rút cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau. Đặc trưng biến đổi của gen NA trong vi rút cúm A là hiện tượng trượt xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA (N1) là 1.410 bp còn lại 1.350 bp.
Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của vi rút, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng vi rút cúm A, bao gồm:
- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1.556 bp, mã hóa tổng hợp nucleotide (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm vi rút, tồn tại trong các hạt vi rút ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.000Da (Luong and Palese, 1992; Murphy and Webster, 1996).
- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1.027 bp, mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của vi rút (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạ ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng 3.000 phân tử MP trên bề mặt capsid của vi rút cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin. Protein M1 là protein nền, là thành phần chính của vi rút có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của vi rút. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11.000 Da là protein chuyển màng - kênh ion cần thiết cho khả năng lây nhiễm của vi rút, chịu trách nhiệm “cởi áo” vi rút trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ.
- Phân đoạn 8 (gen NS) là gen mã hóa protein không cấu trúc, có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của vi rút cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của vi rút nếu thiếu chúng vi rút sinh ra sẽ bị thiểu năng. Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non - structural gen) được tìm thấy ở biến chủng gen A/H5N1/97. NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán là 27.000 Da chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của vi rút từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.000 Da đóng vai trò vận chuyển các RNA của vi rút ra khỏi nhân.
Trong các đoạn trên, đoạn RNA có trọng lượng nhỏ nhất mang mật mã cho 2 loại protein không cấu trúc là NS1 và NS2, chúng dễ dàng được tách ở các tế bào bị nhiễm. Tất cả 8 đoạn của sợi RNA có thể tách và phân biệt dễ dàng qua phương pháp điện di.
1.4.3. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch
Hai protein HA và NA là các protein chính bề mặt capsid (major capsid protein) đặc trưng cho bản chất kháng nguyên của từng chủng vi rút cúm A.
Protein HA (Hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng typ I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu
với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 phân typ HA đã được phát hiện (H1 - H16). Phân typ H16 mới được tìm thấy ở vi rút gây bệnh cho Hải Âu đầu đen - Thụy Điển, ba phân typ (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử. Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một vi rút, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện vi rút và khởi động quá trình xâm nhiễm của vi rút vào tế bào chủ. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ haidưới đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích.
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của vi rút trên vật chủ giúp cho vi rút xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của vi rút cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của vi rút ở các loài vật chủ khác nhau. Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng vi rút cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2, 3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ. Đặc biệt, một số chủng vi rút cường độc A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh).
Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA. Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của vi rút cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng typ HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa vi rút, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của vi rút, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay.
Protein NA (neuraminidase)
Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của vi rút cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân typ NA. Có 9 phân typ (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở vi rút cúm gia cầm, hai phân typ N1 và N2 được tìm thấy ở vi rút cúm người. Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề