Cơ chế hoạt động của Realtime PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.9.2. Cơ chế hoạt động của Realtime PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát

gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (cycle of threshold). Đây là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.

Cúm gia cầm typ A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT - PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là ReverseTranscription nên phương pháp này được gọi là Real Time RT-PCR.

1.9.2. Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang huỳnh quang

Trong kỹ thuật này, Realtime RT- PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) Taqman probe, là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thuỷ giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong các chu kỳ nhiệt được trình bày minh hoạ ở Hình 1.5

Hình 1.5. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe

Có thể tóm tắt như sau: (1) Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ đầu 5’ sẽ bị quencherở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (2) Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp. (3)Taqman probe sẽ bị enzyme Taqman polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (4) Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

2.1. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Gà, vịt được buôn bán tạị chợ và và hộ chăn nuôi gia cầm tại 2 xã Vạn Ninh và Tân Ninh, huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi không gian: - Phạm vi không gian:

+ Địa điểm lấy mẫu: Các cơ sở buôn bán gia cầm tại Chợ Võ Xá và hộ chăn nuôi gia cầm tại 2 xã Vạn Ninh và Tân Ninh, huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình.

+ Địa điểm nghiên cứu: Tại Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình. + Xét nghiệm mẫu tại Phân viện Thú y miền Trung.

- Phạm vi thời gian: Từ tháng 7 năm 2017 đến tháng 2 năm 2018

2.1.3. Nội dung

- Điều tra tình hình dịch bệnh cúm gia cầm (CGC) tại huyện Quảng Ninh thông qua phiếu điều tra.

- Xác định một số yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch cúm gia cầm tại huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình.

- Khảo sát sự lưu hành vi rút CGC tại một số đàn gia cầm của hộ chăn nuôi trên địa bàn huyện Quảng Ninh, Tỉnh Quảng Bình:

+ Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm tại chợ Võ Xá trong thời gian nghiên cứu + Giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm tại đàn chỉ báo trên địa bàn huyện Quảng Ninh trong thời gian nghiên cứu

- Giải trình tự gen H của vi rút CGC và tìm ra các chủng tương đồng.

2.2. Bố trí thí nghiệm

- Để điều tra tình hình dịch bệnh chúng tôi tiến hành lập danh sách các xã đã từng xảy ra dịch cúm gia cầm, trong đó lựa chọn ngẫu nhiên các thôn đã từng có dịch hoặc có nguy cơ cao. Hai danh sách các hộ đã từng có dịch và các hộ chưa có dịch được lập ra. 100 hộ chăn nuôi gia cầm được lựa chọn ngẫu nhiên theo tỷ lệ 1:2 (bệnh : chứng) để tiến hành điều tra. Tổng số 100 phiếu điều tra đã được sử dụng.

- Để khảo sát sự lưu hành vi rút CGC tại đàn chỉ báo trên địa bàn huyện Quảng Ninh trong thời gian nghiên cứu, chúng tôi tiến hành lập danh sách các xã đã từng xảy ra dịch cúm gia cầm. Hai xã Vạn Ninh và Tân Ninh được chọn ngẫu nhiên cho mục đích nghiên cứu. Trong mỗi xã, các thôn đã từng có dịch hoặc có nguy cơ cao đã được lựa chọn và danh sách các hộ chăn nuôi được lập và được sử dụng để tiến hành lấy mẫu.

-Để khảo sát sự lưu hành vi rút CGC tại tại chợ, chúng tôi lập danh sách các chợ trên địa bàn huyện đã từng xảy ra dịch cúm và chọn ngẫu nhiên một chợ để nghiên cứu.

- Mẫu dương tính với vi rút cúm A/H5N6 tại huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình. Được tiến hành giải trình tự gen tại Hãng 1st Base của công ty BioTrace, Singapo.

- Lấy mẫu: mẫu giám sát gộp (swab gộp - gộp10 tăm bông đã lấy dịch hầu - họng của 10 con gia cầm lại thành 1 mẫu) tại một số đối tượng gia cầm (gà, vịt) được thu thập nhằm phát hiện các chủng vi rút CGC có mặt trên địa bàn huyện. Tần suất lấy mẫu là một lần/tháng.

2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Mẫu vật:

Mẫu vật là mẫu Swab được lấy từ gia cầm tại chợ Võ Xá và đàn chỉ báo tại 2 xã Vạn Ninh và Tân Ninh, huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình. Mẫu sau khi thu thập sẽ được vận chuyển đến phòng thí nghiệm của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Bình, sau đó được gửi đi phân tích hàng tháng tại Phân viện Thú y miền Trung.

2.3.2. Nguyên liệu

2.3.2.1. Thiết bị và dụng cụ

- Tủ lạnh âm -20 0C, -80 0C; tủ lạnh thường 2- 8 0C. - Tủ ấm 37 0C.

- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.

- Máy ly tâm lạnh ống eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.

- Máy Realtime PCR Biorad.

- Bộ micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.

- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).

- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...

- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).

2.3.2.2. Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm:

- Mẫu dịch hầu họng (swabs) của gia cầm.

- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH.

- Nước dùng cho sinh học phân tử không có Rnase. - Ethanol tuyệt đối.

- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT

- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).

- Danh sách primer và prober:

Bảng 2.1. Cặp mồi phát hiện vi rút Cúm gia cầm

PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix

Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1

Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None

Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None

H5-9S

Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA- BHQ1

FAM BHQ1

Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None

Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None

Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None

N1-2 China China

Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1

Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None

Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None

N6-1

Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-

BHQ1

FAM BHQ1

Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None

Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None

H7-6 Coda

Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG - BHQ1-3’

FAM BHQ1

Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None

Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None

N9-1 CNIC Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC - BHQ1-3’ FAM BHQ1 Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None Reverse 5’- ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT -3’ None None

* Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR xác định lượng virút CGC.

- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).

- RNA đối chứng dương tính M, H5 của vi rút cúm A/H5N1, A/H5N6. - Hai đoạn mồi oligonucleotit (primer) và probe (mẫu dò).

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.

- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch đệm, Mg2+...

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu

- Cách lấy mẫu swab: Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu dịch nhầy sau đó từ từ rút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Que ngoáy được bảo quản trong dung dịch đệm PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).

Mẫu sau khi được lấy tại các chợ và hộ chăn nuôi gia cầm được bảo quản và gửi về Trạm Chẩn đoán, xét nghiệm thuộc phân viện thú y miền trung để tiến hành xét nghiệm xác định sự lưu hành của vi rút cúm.

Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển được thực hiện theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-83:2011/BNNPTNT được ban hành theo Thông tư số 71/2011/TT- BNNPTNT ngày 25 tháng 10 năm 2011 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn (Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT, 2011).

2.4.2. Phương pháp xét nghiệm: (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2005).

2.4.2.1. Kỹ thuật sử dụng phương pháp real time RT - PCR

-Thu thập mẫu bệnh phẩm

-Real-time Reverse Transeription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) theo trình tự sau:

+ Xét nghiệm tất cả các mẫu (pool) để phát hiện vi rút cúm A.

+ Tất cả các mẫu (pool) dương tính với vi rút cúm A tiếp tục được xét nghiệm để phát hiện subtyp H5 và H7.

+ Tất cả các mẫu dương tính với subtyp H5 tiếp tục được xét nghiệm để phát hiện subtyp N1 và N6; tất cả các mẫu dương tính với subtyp H7 tiếp tục được xét nghiệm để phát hiện subtypN9.

Mẫu được xác định là dương tính với Real time RT- PCR nếu có giá trị Ct ≤35. Mẫu được xác định là âm tính nếu không có giá trị Ct. Mẫu có giá trị Ct >35 được coi là mẫu có kết quả nghi ngờ.

* Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR

- Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số

+ Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Hút pha nước phía trên sang ống eppendorf mới có đánh ký hiệu mẫu.

+ Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở âm 700C.

- Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAamp Viral RNR Mini Handbook – Hãng Qiagen)

+ Cho 500l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA.

+ Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây. + Ủ ở nhiệt độ phòng (15-200C) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.

+ Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh. + Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.

+ Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.

+ Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 200C trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 700C trong thời gian dài.

- Chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix)

Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào ống eppendorf các thành phần với lượng như sau (bảng 2.2)

Bảng 2.2. Thành phần của master mix

TT Nguyên liệu Lượng (µl)

1 DW 4,3

2 2X ReactionBuffer 7,5

PPP

Primer forward (40uM)

0,9 Primer reverse (40uM)

Probe (10uM)

3 Enzyme mix 0,3

Tổng 13

Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.

- Thực hiện phản ứng

Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống eppendorf 0,2 ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau: (Thực hiện theo tiêu chuẩn, quy trình nghành thú y năm 2006).

+ Cho 13µl hỗn hợp master mix vào các tube 0,2 ml.

+ Cho 2µl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng âm. + Cho 2µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp master mix của các tube mẫu.

+ Cho 2µl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương.

Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định.

Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.

- Chạy trên máy Realtime PCR

Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt

máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.

Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như sau (bảng 2.3).

Bảng 2.3. Chu trình luân nhiệt của phản ứng real time RT-PCR

Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

RT 50 0 C 15phút 1 950C 2 phút PCR 95 0 C 10 giây 40 600C 40 giây - Đọc kết quả

Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu swab có vi rút cúm A/H5N1; A/H5N6 trình tự nucleotit của các gen M, H5 và N1, N6 sẽ được khuếch đại đặc hiệu thông qua những đoạn mồi chuyên biệt. Việc xác định sự có mặt của vi rút thông qua phần mềm tạo đường cong và chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct:

+ Đối chứng dương tính cho giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 so với giá trị Ct đã biết.

+ Đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

+ Mẫu dương tính khi đường cong khuyếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct ≤ 35.

+ Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại giống như đối chứng âm tính và không cho giá trị Ct.

+ Mẫu được xác định là nghi ngờ khi đường cong khuếch đại giống đối chứng dương nhưng giá trị ngưỡng Ct >35.

2.4.2.2. Giải trình tự gen HA bằng phương pháp Sanger dideoxy sequencing

Bước 1: Tách chiết RNA hệ gen của vi rút bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Mini

Kit (QIAGEN)- protocol, từ mẫu bệnh phẩm là dịch hầu họng chứa vi rút cúm

A/H5N6 thu thập trong quá trình giám sát sự lưu hành vi rút trong 8 tháng từ tháng