3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4. Giám sát sự lưu hành virút cúm gia cầm tại huyện Quảng Ninh
Để khảo sát và đánh giá sự lưu hành của virút cúm A trên đàn gà và vịt tại huyện
Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình, chúng tôi tiến hành lấy mẫu swab tại chợ Võ xá có nguồn gốc từ nhiều địa phương, điều kiện vệ sinh thú y còn nhiều hạn chế và hộ gia đình (đàn chỉ báo).
Việc lấy mẫu giám sát tại chợ và đàn chỉ báo có ý nghĩa rất lớn trong xác định sự lưu hành vi rút trên địa bàn.
Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra chất lượng mẫu thì tất cả các mẫu được lấy đều đạt yêu cầu kỹ thuật, chúng tôi tiến hành xét nghiệm theo các bước của phương pháp Realtime RT-PCR như đã trình bày ở trên.
Kết quả xét nghiệm mẫu swab trong 8 tháng (7/2017 - 2/1018) trên gà và vịt như sau:
3.4.1. Kết quả giám sát vi rút cúm gia cầm tại chợ theo thời gian
Từ tháng 7/2017 đến tháng 2/2018 thực hiện lấy mẫu swab hầu họng tại chợ Võ Xá. Kết quả thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Kết quả giám sát vi rút cúm gia cầm tại chợ theo thời gian
Thời gian Số mẫu Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) M H5 H7 N1 N6 M H5N1 H5N6 7/17 3 1 0 0 - - 33,33 0 0 8/17 3 3 0 0 - - 100 0 0 9/17 3 2 0 0 - - 66,66 0 0 10/17 3 3 0 0 - - 100 0 0 11/17 5 0 0 0 - - 0 0 0 12/17 5 0 0 0 - - 0 0 0 1/18 5 2 1 - 0 1 40 0 20 2/18 5 2 0 0 - - 40 0 0 Tổng 32 13 1 0 0 1 40,63 0 3,13 (-): Không xét nghiệm
Qua bảng 3.13 nhận thấy:
Tại chợ Võ Xá qua 8 lần lấy mẫu với tổng số 32 mẫu giám sát, có 13/32 mẫu dương tính với gen M (tỷ lệ 40,63 %). Tiếp tục xét nghiệm với 13 mẫu dương tính gen M để xác định subtyp H, có 1 mẫu dương tính với subtyp H5, 12 mẫu còn lại tiếp tục xét nghiệm để xác định subtyp H7, không có mẫu nào dương tính với subtyp H7.Trong 1 mẫu dương tính subtyp H5 đem xét nghiệm để xác định subtyp N1 và N6, 1 mẫu dương tính với subtyp N6 (3,13%). Như vậy có sự lưu hành vi rút cúm A/H5N6 với tỷ lệ 3,13%. Cụ thể qua các tháng như sau:
Gia cầm bán tại các chợ được kiểm tra tại thời điểm tháng 7 năm 2017 có tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A là 33,33%, nhưng không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7.
Tại thời điểm tháng 8 năm 2017 tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A trên gia cầm bán tại các chợ lấy mẫu giám sát là 100%, không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7.
Tháng 9 năm 2017, tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A trên gia cầm bán tại các chợ lấy mẫu giám sát là 66,66%, nhưng không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7
Tháng 10 năm 2017, tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A trên gia cầm bán tại các chợ lấy mẫu giám sát là 100%, nhưng không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7.
Ở thời điểm tháng 11và tháng 12 năm 2017 không phát hiện sự lưu hành cúm A. Tại thời điểm tháng 1 năm 2018, gia cầm bán tại các chợ có tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A là 40%, với subtyp H5 là 20% và subtyp N6 là 20%.
Tại thời điểm tháng 2 năm 2018, gia cầm bán tại các chợ có tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A là 40%, nhưng không có mẫu nào dương tính với subtyp H5và H7
Từ kết quả trên có thể thấy rằng, có sự lưu hành vi rút (tỷ lệ dương tính) cúm A vào tháng 7,8,9,10 năm 2017 và tháng 1 và tháng 2 năm 2018. Tháng 11 và 12 năm 2017 không có sự lưu hành vi rút cúm A. Tháng 1 năm 2018 có sự lưu hành vi rút cúm A/H5N6
Như vậy tại chợ Võ Xá có sự lưu hành vi rút cúm A/H5N6, không có sự lưu hành vi rút A/H5N1, A/H7N9.
Sự lưu hành vi rút cúm A chủ yếu vào tháng 8 đến tháng 10 năm 2017, tháng 1 và tháng 2 năm 2018 do điều kiện thời tiết bất lợi mưa nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho vi rút tồn tại trong môi trường, nhưng là điều kiện bất lợi làm giảm sức đề kháng của đàn gia cầm. Hơn nữa, đây là thời gian chuẩn bị bước vào đợt tiêm phòng mới nên
thời gian bảo hộ thấp hoặc đã hết. Đặc biệt tháng 1 là thời điểm diễn ra tết cổ truyền và nhiều lễ hội khác nên các hoạt động buôn bán, vận chuyển, giết mổ gia cầm tăng cao, cùng với một số bộ phận dân cư thường lơ là, chủ quan trong công tác phòng dịch làm cho mầm bệnh dễ phát tán, lây lan dịch bệnh. Trong khi đó vào tháng 7, do thời tiết nắng nóng là sự bất lợi cho cho sự tồn tại mầm bệnh trong môi trường nên tỷ lệ lưu hành vi rút cúm gia cầm thấp hơn so với tháng 8, tháng 9, tháng 10 năm 2017, tháng 1 và 2 năm 2018. Như vậy, tỷ lệ lưu hành vi rút cúm A/H5N6 Tại chợ Võ Xá trên địa bàn huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình là 3,13%.
Biến động lưu hành vi rút cúm gia cầm tại chợ buôn bán gia cầm sống được thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2. biến động lưu hành vi rút cúm tại chợ Võ Xá
3.4.2. Lấy mẫu giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm tại đàn chỉ báo.
Từ tháng 7/2017 đến tháng 2/2018 thực hiện lấy mẫu swab hầu họng tại 2 xã: Vạn Ninh, Tân Ninh. Kết quả thể hiện ở bảng 3.14
Bảng 3.14. Kết quả giám sát vi rút cúm gia cầm tại đàn chỉ báo theo thời gian Thời gian (Tháng) Số mẫu Kết quả xét nghiệm M H5 H7 Số mẫu + Tỷ lệ (%) Số mẫu + Tỷ lệ (%) Số mẫu + Tỷ lệ (%) 7/17 5 0 0 - 0 - 0 8/17 5 0 0 - 0 - 0 9/17 5 3 60 0 0 0 0 10/17 5 1 20 0 0 0 0 11/17 5 1 20 0 0 0 0 12/17 5 1 20 0 0 0 0 1/18 5 1 20 0 0 0 0 2/18 5 1 20 0 0 0 0 Tổng 40 8 20 0 0 0 0 (-)Không xét nghiệm Qua bảng 3.14 ta thấy:
Tại hộ chăn nuôi (đàn chỉ báo): Qua 8 lần lấy mẫu với tổng số 40 mẫu giám sát, có 8/40 mẫu dương tính với gen M (tỷ lệ 20%). Tiếp tục xét nghiệm với 8 mẫu dương tính gen M để xác định subtyp H, không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7. Như vậy, không có sự lưu hành cúm A/H5N6, A/H5N1, A/H7N9 tại hộ chăn nuôi trong thời điểm giám sát. Cụ thể qua các tháng như sau:
Gia cầm ở các hộ chăn nuôi được kiểm tra tại thời điểm tháng 7 và 8 không có sự lưu hành vi rút cúm A.
Tháng 9 tỷ lệ dương tính với cúm A là 60% không có mẫu dương tính với subtyp H5 và H7.
Từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 2 năm 2018 tỷ lệ dương tính với vi rút cúm A là 20%, nhưng không có mẫu nào dương tính với subtyp H5 và H7.
Từ kết quả trên có thể thấy rằng, Sự lưu hành cúm A cao nhất chủ yếu xảy ra vào tháng 9 (60%), từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 2 năm 2018 tỷ lệ lưu hành vi rút cúm A là 20%. Tháng 9 năm 2017 là thời điểm giao mùa, lượng mưa nhiều kiện thuận lợi cho vi rút tồn tại trong môi trường, nhưng cũng làm cho gia cầm giảm sức đề kháng, mặt khác vào tháng 9 là thời điểm cuối của đợt tiêm phòng định kỳ được tổ chức từ tháng 3 đến tháng 4 trong năm tại các địa phương hoặc được nuôi mới nhưng chưa được tiêm phòng nên thời gian bảo hộ thấp hoặc đã hết nên làm cho mầm bệnh dễ phát tán, lây lan dịch bệnh.
Như vậy tại đàn chỉ báo không có sự lưu hành vi rút cúm A/H5N1, A/H5N6, A/H7N9
Biến động lưu hành vi rút cúm gia cầm tại đàn chỉ báo được thể hiện ở hình 3.3
3.4.3. Kết quả giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm tại chợ và hộ chăn nuôi (đàn chỉ báo). chỉ báo).
Bảng 3.15. Kết quả giám sát vi rút cúm gia cầm tại đàn chỉ báo và chợ
Địa điểm Số lượng mẫu
Kết quả xét nghiệm M H5N6 Số mẫu + Tỷ lệ (%) Sốmẫu + Tỷ lệ (%) Chợ 32 13 40,63 1 3,13 Đàn chỉ báo 40 8 20 0 0 Tổng 72 21 29,16 1 1,38
Từ bảng 3.15 ta thấy tỷ lệ lưu hành vi rút cúm A (gen M) tại chợ cao hơn đàn chỉ báo là 40,63%, phù hợp với kết quả giám sát cúm gia cầm năm 2015 (Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình, 2017), ở chợ phát hiện tỷ lệ lưu hành vi rút cúm A/H5N6 là 3,13% trong khi đó hộ chăn nuôi không phát hiện sự lưu hành vi rút cúm gia cầm A/H5N6, phù hợp với kết quả giám sát cúm gia cầm năm 2016. (Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình, 2017). Một trong những nguyên nhân là: Ở ngoài môi trường vi rút cúm ít có khả năng tồn tại trong thời gian dài do tác động của các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ cũng như việc các chủ kinh doanh gia cầm thực hiện công tác vệ sinh, tiêu độc.Tuy nhiên, việc tiêu độc khử trùng tại chợ không được thực hiện thường xuyên nên vi rút vẫn có khả năng tồn tại trong môi trường và ở rất nhiều nơi khác như chất thải trên lồng nhốt, phân tươi, nước thải. Điều này có nghĩa rằng, công tác tốt vệ sinh môi trường, định kỳ phun tiêu độc khử trùng các điển buôn bán gia cầm đóng một vai trò rất lớn trong việc ngăn chặn sự tồn tại, phát sinh dịch bệnh, mặt khác do chợ Võ xá nằm sát đường quốc lộ 1A, có các hộ buôn bán gia cầm từ nhiều nơi đổ về không truy xuất được nguồn gốc do khai báo không chính xác nên mầm bệnh dễ phát tán, lây lan dịch bệnh.
Hình 3.4. Tỷ lệ lưu hành vi rút cúm tại đàn chỉ báo và chợ
3.4.4. Kết quả giám sát lưu hành vi rút cúm gia cầm trên gà và vịt trong thời gian
nghiên cứu
Bảng 3.16. Kết quả giám sát vi rút cúm gia cầm trên gà và vịt
Loài Số lượng mẫu
Kết quả xét nghiệm Gen M Gen H5N6 Số mẫu + Tỷ lệ (%) Số mẫu + Tỷ lệ (%) Gà 36 6 16,66 0 0 Vịt 36 15 41,66 1 2,77 Tổng 72 21 29,16 1 1,38
Với kết quả ở bảng 3.16 ta thấy: Tỷ lệ lưu hành vi rút cúm A (gen M) ở huyện Quảng Ninh trên vịt cao hơn gà là 25%, trên vịt phát hiện sự lưu hành vi rút cúm A/ H5N6 với tỷ lệ (2,77%), trên gà không phát hiện sự lưu hành vi rút cúm A/H5N6.
Điều này có thể giải thích do một số nguyên nhân: Thứ nhất, hầu hết việc chăn nuôi vịt tại xã Tân Ninh, Xã Vạn Ninh được chăn thả tự do trên các cánh đồng, kênh mương, ao chung với các xã của huyện Lệ Thủy là yếu tố thuận lợi cho vi rút tiếp xúc và lây lan trên các đàn vịt. Thứ hai, gà được chăn thả trong vườn hoặc được nhốt trong chuồng nên ít có điều kiện cho vi rút cúm xâm nhập và gây bệnh.
Hình 3.5. Tỷ lệ lưu hành vi rút cúm trên gà và vịt
3.5. Kết quả giải trình tự Gen HA chủng H5N6 phân lập được tại huyện Quảng Ninh
Dịch tễ học phân tử không phải là một khái niệm quá mới, với đặc tính biến đổi liên tục của vi rút cúm gia cầm luôn là bài toán khó với những nhà nghiên cứu, các công ty sản xuất vắc xin. Do đó việc nghiên cứu sự biến đổi của các chủng vi rút cúm gia cầm theo thời gian và không gian là điều hết sức cần thiết.
3.5.1. Đánh giá kết quả thực hiện giải trình tự
Tại Quảng Ninh, sau 8 tháng thực hiện giám sát (Lấy mẫu swab hầu họng gia cầm) chúng tôi thu được 01 mẫu dương tính. Mẫu được tiến hành giải trình tự tại công ty 1st Base. Quy trình thực hiện được tiến hành bằng phương pháp bằng phương pháp Sanger dideoxy sequencing. Kết quả giải trình tự được trích xuất dưới dạng mặc định (*ab1) được đọc bằng phần mềm Bioedit. Qua hình 3.6 và 3.7 giản đồ trình tự tự động chúng ta có thể đánh giá được việc thực hiện của Hãng:
Hình 3.6. Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Forward của chủng LC376800 BIO TRACE BioEdit v ersion 7.0.5.3 (10/28/05) Model 3730 KB.bcp 6258000-04 6258002-04 6258003-03 6258005-00 File: 1s t_BASE_3058149_QN53_2_primer_2R.ab1 3058149_QN53_2_primer_2R Lane 93 Signal G:1341 A:1782 T:2805 C:2342 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 2047 to 18360 A ACTGTA TG 10 CACT TCTGCA 2 0 T TGTACGAC C 30 CAT TG GAGCA 40 CATC CATA A A 50 GATAGAC CAG 60 C CACA ATGAT 70 TGC CAGTGCT 8 0 AG G GA ACTCG 90 C CACTGT TGA 100 ATA A AT TGAC 110 AGTAT T TG G T TCT TC 16 0 CCT T T T TA AT 170 CT TGC CTCT T 180 CTGA ATACTG 190 G G GATAGTCA 20 0 TACGTC C CAT 2 10 T TCT TACACT 220 T TC CATACAT 230 TCAT TATCAC 2 40 AT T TATGATA 2 50 GA ACTCGA A A 260 CA AC CAT TAC 2 70 CTAGCT TCATA A AG G 320 T TCT T TACAT 330 T TGA ATCGTG 3 40 A A A ATCTA A A 350 GT TCTCTCAT 360 T T TC CATGAG 370 A ACTA A A AGT 380 TCAGCAT TGT 3 90 A AGTC CAGAC 400 ATCTAG GAAT 410 C CGTCT TC CA 42 0 T T T TCT TAT T 43 0 TA A AT TC ACG GC CT 480 CA A AT TGAGT 490 GT TCAT T T TG 500 C CGAT TATCG 510 AGT TGAC CT T 520 AT TG GTA ACT 530 C CATCTAT TG 540 C CT T T TG G GT 550 G GAT TCTCTG 56 0 TCTGCAGCGT 570 AC C CACTC C C 580 CTGT TCAT TG 590 CTATG GTG G TC C CTC 640 TATGA AC C CT 650 GCTATAGCTC 660 CA A ATAGTC C 6 70 TCTCT T TCT T 680 CT TCT T TCTC 690 T TA A AG GACT 700 AT T TCTGAGT 7 10 C CAGTCGCA A 720 G GACTA AT T T 730 GT T TGAT T TC 740 ACGTAT T TG G 750 G GCACTC ATACTAGAG 8 00 T T TATCGC C C 810 CTAT TG GAGT 8 20 T TGACAT T TG 830 GTGT TGCAGT 840 G GC CATAT TC 850 CAT T TCACT T 8 60 T TCATA AT TG 870 T TGAGTCCT T 88 0 T TCTCTGTA A 890 A A A AG G
Hình 3.7. Giản đồ giải trình tự tự động đoạn Gen H5 với primer Reverse của chủng LC376800
Chúng tôi đã thực hiện giải trình tự 4 lần: 2 lần thực hiện tinh sạch với primer Forward và 2 lần chạy với primer Reverse. Kết quả trình của 4 lần sẽ được xử lý bằng phần mềm Bioedit để xác định được một trình tự chính xác hơn.
Qua hình 3.6 và 3.7 ta có thể thấy việc giải trình tự mẫu thực hiện tinh sạch với primer Forward không tốt, tín hiệu giải trình (thể hiện qua đường cong) các Nucleotic không đồng đều. Kết quả giải trình tự thực hiện mẫu đã tinh sạch bằng prime Reverse rất tốt thể hiện qua sự đồng đều của tín hiệu giải trình . Các giá trị không quá cao hoặc không quá thấp ở phần giữa của trình tự. Đây là đánh giá ban đầu thể hiện sự chính xác trong việc xác định trình tự chính xác của Chủng phân lập trước khi được chấp nhận đưa lên Gen Bank. Qua so sánh kết quả giải trình tự của mẫu bằng 2 primer ta có thể nhận thấy primer Reverse cho ra kết quả tốt hơn, việc tinh sạch bằng prime Reverse phù hợp hơn với Gen H5 của chủng phân lập tại huyện Quảng Ninh, tỉnh Quảng Bình.
Kết quả được đăng tải trên gen bank: Chủng LC376800
Trình tự Nucleotic ORIGIN
1 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 61 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 121 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 181 aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tcttggaaac 241 ccaatgtgcg acgaattcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gaggactaac 301 ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 361 ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccaat 421 catgaaacat catcaggggt gagcgcagca tgcccatacc agggagtgcc ctcctttttc 481 agaaatgtgg tatggcttac caagaagaac gatgcatacc caacaataaa gatgagctac 541 aataatacca atggggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaatgaa 601 gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 661 ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacaagga 721 agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt tgagagtaat 781 ggaaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaatagtca agaaagggga ctcaacaatt 841 atgaaaagtg aaatggaata tggccattgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 901 ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga gtgccccaaa 961 tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tttaagagaa 1021 agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt tcatagaggg aggatggcaa 1081 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1141 gcagacagag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgata 1201 atcgacaaaa tgaacactca atttgaggcc gttgggaggg agtttaataa cttagaacgg
1261 agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttacaat 1321 gctgaacttt tagttctcat ggaaaatgag agaactttag attttcacga ttcaaatgta 1381 aagaaccttt atgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctaggtaat 1441 ggttgtttcg agttctatca taaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1501 acgtatgact atccccagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagggaaga aataagcgga 1561 gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1621 tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1681 ttacaatgca gaatttgcat ttaa
Trình tự được đối chiếu và đánh giá bằng lệnh Blast (NCBI) tìm kiếm những chủng đã được phân lập và đăng tải trình tự lên Genbank.