3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai nhân tố ANOVA và kiểm định LSD (5%) để so sánh sự khác biệt trung bình giữa các nghiệm thức cũng như sự biến động giữa các lần lặp lại trong cùng nghiệm thức theo thời gian. Xử lý thống kê số liệu
thực nghiệm sử dụng phần mềm tiêu chuẩn SPSS 20. Kết quả xử lý thể hiện ở phần phụ
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH NẤM TỪ QUẢ QUÝT HƯƠNG CẦN 3.1.1. Phân lập nấm
Nấm bệnh gây hại xuất hiện bên ngoài vỏ quả quýt trên cây và trong thời gian bảo
quản quýt làm cho quả quýt bị mốc, có hình thái sợ nấm màu trắng, xốp.
Dùng que kẹp vô trùng lấy các mẫu nấm bên ngoài vỏ quả quýt sang môi trường
PDA và nuôi ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.1. Nấm bệnh trên quả quýt Hương Cần
Sau 2 ngày, phân lập được 6 mẫu nấm (ký hiệu QB1, QB2, QB3, QB4, QB5,
QB6) từ các quả quýt Hương cần bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, cả 6 mẫu nấm đều có màu sắc, hình thái giống nhau. Nấm sau khi phân lập, ban đầu sợi nấm mẹ thưa, có màu trắng
dần dần chuyển sang màu tro, phân tán đều theo hướng thành đĩa peptri. Các sợi nấm
mọc hướng lên trên, bản nấm xốp và có kích thước 1 - 3mm. Tuy chúng tôi phân lập được 6 mẫu nấm nhưng hình thái bên ngoài giống nhau và khi định danh bằng phương
pháp giải trình tự ITS đều có kết quả như nhau. Vì vậy, kết quả phân lập chỉ giới thiệu
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của nấm bệnh ở quả quýt Hương Cần trên môi trường PDA
3.1.2. Định danh nấm
Các mẫu nấm sau khi được phân lập và định danh tại công ty TNHH Dịch vụ và
Thương mại Nam Khoa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, thành phố
Hồ Chí Minh, Việt Nam bằng phương pháp giải trình tựITS, trình tự nucleotide của 6
mẫu nấm giống nhau và được trình bày ở Hình 3.3
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gene của chủng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần
Tra cứu trên BLAST search (NCBI)
Hình 3.4. Kết quả tra cứu bằng công cụ BLAST search (NCBI)
Việc so sánh trình tự gene rRNA 28S của 6 mẫu nấm bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, trình tự gene tương đồng đến 100% với chủng Macrophoma theicola.
Kết quảnày đã cho phép kết luận rằng 6 mẫu nấm là loài Macrophoma theicola. Để
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn một mẫu nấm và ký hiệu
Macrophoma theicola: nấm được phát hiện đầu tiên trên cây chè, có khả năng
làm giảm sản lượng và làm ảnh hưởng rất lớn đến kinh tế sản xuất ngành chè [25].
- Phân loại khoa học [44]: + Ngành : Ascomycota. + Lớp : Dothideomycetes.
+ Phân lớp: Incertae sedis.
+ Bộ: Botryosphaeriales.
+ Họ: Botryosphaeriaceae.
+ Giống: Macrophoma.
+ Loài: Macrophoma theicola.
- Đặc điểm sinh học của Macrophoma theicola
Macrophoma theicola lây lan dễ dàng trong điều kiện mưa, ẩm ướt. Nhiệt độ tăng trưởng là 28 – 340C, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 320C. Macrophoma theicola phát triển ở
trên nhánh, lá và quả. Trên lá làm héo nhanh chóng, cuối cùng lá khô, rụng lá. Trên nhánh hình thành các vết loét, vết bệnh lõm (nhiều nơi gọi là loét cành). Nếu bệnh trên quả làm cho quả bị mốc trắng và mất nước cho đến quả khô [25]. Tại các nhà vườn ở xã
Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, các hộ trồng quýt cũng mô tả
những hiện tượng của nấm bệnh như trên.
Qua quá trình tham khảo, chưa có đề tài nào công bố liên quan đến nấm này trên
đối tượng quả có múi nói chung và đối tượng quả quýt nói riêng mà chỉ ghi nhận xuất
hiện và gây bệnh trên đối tượng chè. Với kết quả từ việc phân lập, định danh cho thấy có
thể xảy ra sự biến thể và thích nghi với môi trường khác đối với loại nấm này, và cũng từ
kết quả này có thể làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo đối với loại nấm
Macrophoma theicola trên đối tượng cây có múi để đề ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu.
3.2. KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM ĐÃ ĐƯỢC ĐỊNH DANH BỞI CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI NANO BẠC-CHI
Sau khi khảo sát hiệu quả khả năng kháng loại nấm mới gây bệnh trên quả quýt Hương Cần, Macrophoma theicola ở điều kiện in vitro và in vivo. Để tăng hiệu quả ứng
dụng, chúng tôi sử dụng chế phẩm này để xử lý quả quýt sau thu hoạch với các nồng độ
khác nhau nhằm kéo dài thời gian bảo quản. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung
khảo sát sự ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến các thành phần hóa học như hàm lượng vitamin C, acid tổng số, đường tổng số cũng như sự hao hụt khối lượng và tỷ lệ hư
3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro
Tính kháng khuẩn của chế phẩm được thể hiện bằng sự ức chế, hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Vì vậy, dựa vào sự phát triển sợi nấm trên đĩa thạch, có
thể xác định được tính kháng khuẩn của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan đối với
nấm cần nghiên cứu.
Sau 6 ngày theo dõi khả năng kháng nấm Macrophoma theicola QB1 trên môi
trường PDA có sử dụng chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan với các nồng độ khác nhau
(0%- đối chứng; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%) và các ký hiệu tương ứng: mẫu 1; mẫu 2;
mẫu 3; mẫu 4 và mẫu 5; kết quả thể hiện qua Hình 3.5 và Bảng 3.1.
Mẫu 1 Mẫu 2
Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nano bạc-Chi đến khảnăng sinh trưởng tản nấm Macrophoma theicola QB1 sau 6 ngày theo dõi
Nồng độ nano bạc-Chi (%)
Đường kính tản nấm (cm)
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày
0 2,5cA 4,9cB 8,6cC 8,6cC 8,6cC 8,6cC
0,2 0,3bA 0,5bB 0,9bC 0,9bC 0,8bC 0,9bC
0,4 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
0,6 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
0,8 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
Ghi chú: Các chữ cái thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95 %, trong đó a, b, c theo hàng cột và A, B, C theo hàng ngang.
Số liệu ở Bảng 3.1 cho thấy tất cả các mẫu có xử lý bằng nano bạc-Chi đều có ảnh hưởng sự phát triển của đường kính tản nấm. Đường kính tản nấm giảm dần khi nồng độ
chế phẩm nano bạc-Chi tăng lên. Ở mẫu 1 (ĐC), sau 1 ngày đã xuất hiện sợi nấm màu trắng, mọc tỏa theo hình tròn hướng về thành đĩa petri, ĐKTN trung bình 2,5 cm. Sau 3
ngày, lượng nấm phát triển nhiều hơn và tràn đầy mặt đĩa và sau 6 ngày sợi nấm chuyển sang giai đoạn già hóa nên chuyển sang màu tro xám. Đường kính tản nấm trung bình ở
mẫu 2là 0,3 cm; 0,5 cm và 0,9 cm tương ứng sau 1 , 2 và 3 ngày theo dõi, từ ngày thứ 4 không tăng, sợi nấm không phát triển và bắt đầu bị già hóa. Ở các mẫu còn lại tương ứng
với nồng độ nano bạc-Chi 0,4; 0,6 và 0,8 %, sự sinh trưởng của nấm bị ức chế hoàn toàn
ở ngày đầu tiên.
Trong điều kiện in vitro, khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh Macrophoma theicola, Võ Văn Quốc Bảo và cs (2018). cho thấy các hạt nano bạc đã thể hiện tác dụng ức chế đối với nấm này đối với chế phẩm nano bạc-TBS ở nồng độ 10 ppm và có hiệu
quả ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm từ nồng độ 30 ppm [1]. Cơ chế tác dụng của nano
bạc đối với nấm được đánh giá ở các nồng độ khác nhau, gây tổn thương trực tiếp đến
màng tế bào, ức chế quá trình nhân đôi DNA và vô hiệu hóa các enzyme dẫn đến ức chế
và tiêu diệt sự phát triển của nấm [15], [19], [27]. Như vậy, kết quả nghiên cứu khả năng
kháng nấm Macrophoma theicola QB1 của chế phẩm nano bạc – Chi tương đồng với
3.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vivo
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 trên quả
quýt Hương Cần trong điều kiện in vivo ở Hình 3.6 cho thấy có sự ảnh hưởng của chế
phẩm nano bạc-Chi đến khả năng hạn chế nhiễm bệnh.
Hình 3.6. Tỷ lệ quả quýt bị nhiễm nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 sau khi nhúng nano bạc-Chi ở các nồng độ khác nhau
Qua kết quả thể hiện ở Hình 3.6, tất cả các nồng độ xử lý, tỷ lệ kháng bệnh ở các
nồng độ xử lý chế phẩm nano bạc-Chi vượt trội so với đối chứng. Nồng độ của chitosan bổ sung vào dung dịch nano bạc càng cao, khả năng ức chế sinh trưởng của nấm bệnh
càng lớn, hiện tượng nhiễm bệnh xuất hiện tại các vết thương nhân tạo càng ít. Ở nồng độ chitosan 0,2%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 42,2%; 0,4%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 17,8%; và từ
0,6% không thấy xuất hiện vết bệnh. Kết quả của Võ Văn Quốc Bảo và cs. khi khảo sát
sự ảnh hưởng nano bạc-TBS cùng trên loại nấm Macrophoma theicola QB1 trong điều
kiện in vivo cũng cho thấy khả năng kháng nấm đối với chủng nấm gây bệnh này đạt tỷ
lệ càng cao khi nồng độ chế phẩm càng lớn [1], [31]. Hơn nữa, kết quả của Kim và cs. về
tác dụng kháng nấm hiệu quả của hạt nano bạc chống lại nấm gây bệnh trên thực vật và trên quả cà chua, ớt, dưa hấu, dưa chuột, lê, dâu tây,…khi nồng độ càng tăng dần [9], [22]. Như vậy, kết quả mà chúng tôi đạt được tương đồng với nhóm các tác giả đã công bố ở trên. Điều này có thể là do nano bạc tham gia hiệu quả trong hiệu ứng phối hợp
chitosan tạo thành một màng bán thấm bao bọc quanh quả có tác dụng chống lại sự xâm
nhập của mầm bệnh. Hơn nữa nano bạc còn có tác dụng như một chất kích kháng ngoại
bào, tạo sức đề kháng cho vật chủ [29], [32]. Tuy vậy, trên bề mặt của quả quýt sau thu
có hiệu quả tác dụng ức chế của chế phẩm nano bạc-Chi trong điều kiện in vivo sẽ kém hơn so với điều kiện in vitro.
3.3. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BẢO QUẢN QUÝT HƯƠNG CẦN BẰNG CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH PHẨM NANO BẠC-CHI Ở ĐIỀU KIỆN LẠNH
Sau khi khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro và in vivo, chúng tôi nhận thấy chủng Macrophoma theicola là nấm gây bệnh mới
trên quả quýt Hương Cần và đã xử lý chế phẩm nano bạc-Chi rất hiệu quả. Chính vì vậy, để theo dõi quá trình bảo quản quýt Hương Cần sau thu hoạch, trong phần nghiên cứu
tiếp theo này chúng tôi tập trung nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần bằng
chế phẩm nano bạc có sự kết hợp chitosan trong điều kiện lạnh 130C, độ ẩm 80% đến
95%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung khảo sát sự ảnh hưởng của chế phẩm
nano bạc-Chi đến các thành phần như hàm lượng vitamin C, acid tổng số, đường tổng số
cũng như sự hao hụt khối lượng và tỷ lệ hư hỏng, đồng thời cũng đánh giá giá trị cảm
quan của quýt khi sử dụng chế phẩm trong quá trình bảo quản.
3.3.1. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng vitamin C của quýt trong quá trình bảo quản trong quá trình bảo quản
Vitamin C có vai trò hết sức quan trọng đối với con người và là một trong những
thành phần quan trọng trong nhiều loại rau quả, chất chống oxy hóa ở tế bào thực vật. Tuy nhiên, hàm lượng vitamin C sẽ giảm mạnh theo thời gian bảo quản.
Sự biến đổi hàm lượng vitamin C quả quýt theo thời gian bảo quản được thể hiện qua đồ thị Hình 3.7.
Hình 3.7. Đồ thị biến đổi hàm lượng vitamin C của quýt trong thời gian bảo quản với các công thức khác nhau
Số liệu thể hiện trên Hình 3.7 cho thấy hàm lượng vitamin C tăng lên trong 10 và
15 ngày đầu, tương ứng nhóm mẫu ĐC, CT1 và nhóm mẫuCT2, CT3, CT4 nhưng sau đó giảm dần theo thời gian. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình chín tới, hàm
lượng đường trong quả được tổng hợp và chuyển hóa một phần thành vitamin C và sau
đó các thành phần này chuyển hóa, thủy phân và phân hủy để chuyển thành các hợp chất khác như acid hữu cơ, các thành phần gây hư hỏng. Ngoài ra vitamin C lại dễ bị oxy hóa
do không khí xâm nhập và quá trình khử các mô đã phá hủy vitamin C trong quá trình bảo quản.
Mẫu ĐC có tốc độ giảm mạnh nhất, tại ngày bảo quản thứ 30, hàm lượng vitamin
C còn 14,17 mg%, giảm 58,2% so với ban đầu. Tại thời điểm này, lô quýt ở mẫu ĐC có
màu vàng héo, da quả nhăn không đảm bảo tiêu chuẩn để sử dụng theo tiêu chuẩn TCVN
1873:2014 [14]. Đối với các mẫu được xử lý chế phẩm nano bạc-Chi có thể kéo dài thời
gian bảo quản đến 60 ngày (CT1) và 65 ngày ( CT2, CT3, CT4) tương ứng với tỷ lệ phần trăm khối lượng vitamin C giảm so với ban đầu là 56,8% và 53,2%, 37,5%, 35,3%.
Theo kết quả đã công bố về bảo quản quýt bằng chế phẩm nano bạc có bổ sung tinh
bột sắn của nhóm tác giả Võ Văn Quốc Bảo và cs. (2018) và nghiên cứu bảo quản cam
bằng màng chitosan của Nguyễn Thị Hạnh (2009); kết quả nghiên cứu của chúng tôi đạt được tương đồng với quy luật biến đổi hàm lượng vitamin C trong quá trình bảo quản đối
với quả có múi, tuy nhiên nhờ kết hợp bảo quản trong điều kiện lạnh nên hàm lượng
vitamin C ở nghiên cứu này giảm chậm hơn và kéo dài thời gian lưu trữhơn [5], [31]. Từ các kết quả thu nhận được cho thấy CT3 và CT4 có hàm lượng vitamin C
giảm ít hơn so với các mẫu ở công thức ĐC, CT1, CT2 và giữa chúng không có sự khác
biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
3.3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến hàm lượng acid tổng số của quýt trong quá trình bảo quản trong quá trình bảo quản
Các acid đóng vai trò quan trọng trong thành phần rau quả cũng như trong quá
trình bảo quản và chế biến. Acid hữu cơ trong quả quýt tương đối cao, chủ yếu acid citric, đóng vai trò quan trọng trong thành phần dinh dưỡng của quả. Acid có trong nguyên liệu
quýt tạo cho quả có vị chua nhẹ và hương thơm đặc trưng. Sự biến đổi hàm lượng acid
Hình 3.8. Sự biến đổi hàm lượng acid tổng số của quýt trong thời gian bảo quản
Đồ thị ở Hình 3.8 ta thấy hàm lượng acid tổng số của tất cả các công thức có xu hướng tăng dần trong giai đoạn đầu và sau đó giảm dần. Mẫu ĐC tăng nhanh hơn so với các mẫu có xử lý chế phẩm nano bạc-Chi và hàm lượng acid tổng số tăng nhanh nhất vào ngày bảo quản thứ 15 với giá trị xác định được 0,78% tăng 47,2% so với ban đầu, sau đó giảm dần và kết thúc quá trình bảo quản vào ngày bảo quản thứ 30 tương ứng với giá trị
là 0,68%.
Hàm lượng acid của mẫu CT1 và CT2 đạt giá trị cao nhất lần lượt là 0,80% và 0,76% tại ngày bảo quản thứ 30 và ngày bảo quản thứ 35, tăng tương ứng 51% và 43,4%
so với ban đầu. Sau thời gian đó, hàm lượng này giảm dần đến khi kết thúc bảo quản tại
ngày bảo quản thứ 60 và 65 với giá trị tương ứng là 0,64% và 0,63%.
Hàm lượng acid của mẫu CT3 và CT4 đạt cực đại vào ngày bảo quản thứ 35 và
giảm đều đến ngày thứ 65 còn 0,69% và 0,68% tương ứng với các mẫu.
Kết quả cho thấy hiệu quả bảo quản quả quýt có xử lý nano bạc-Chi kết hợp với