3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.1. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu
2.1.1.1. Địa điểm:
Phòng thí nghiệm khoa Cơ khí – Công nghệ trường Đại học Nông Lâm Huế.
2.1.1.2. Thời gian nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành vào tháng 06/2017 đến tháng 06/ 2018
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Quýt được thu hoạch tại thôn Giáp Kiền, xã Hương Toàn, thị xã Hương Trà,
tỉnh Thừa Thiên Huế.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Định danh nấm từ quả quýt Hương Cần.
- Khảo sát khảnăng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi.
- Nghiên cứu ứng dụng bảo quản quýt Hương Cần từ chế phẩm nano bạc-Chi ở
nhiệt độ 130C, độẩm 80% đến 95%.
2.2.1. Phân lập, định danh nấm từ quả quýt Hương Cần
Quýt chứa nhiều nước, vitamin C, đường và còn nhiều thành phần dinh dưỡng khác, là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật phát triển nên đã ảnh hưởng đến công đoạn bảo quản, lưu trữ quýt.
Hiện nay, trên quả quýt Hương Cần thường xuất hiện những bệnh hại và nấm gây
bệnh màu trắng, xốp làm cho quả quýt bị mốc. Quả quýt nhiễm nấm bị mất nước, khô
cuống và rụng.Để góp phần nghiên cứu khả năng kháng bệnh trên quả quýt Hương Cần
chúng tôi tiến hành phân lập nấm gây bệnh này, chúng tôi giới thiệu tóm tắt sơ đồ phân
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập nấm từ quả quýt Hương Cần
2.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc-Chi với nấm được phân lập trên quả quýt Hương Cần phân lập trên quả quýt Hương Cần
2.2.2.1. Khảo sát ởđiều kiện in vitro
Để kiểm tra khả năng kháng nấm của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan, chúng
tôi thực hiện thí nghiệm trên chủng nấm gây bệnh được phân lập từ quả quýt Hương
Cần. Kết quả thu nhận dựa vào khả năng phát triển của nấm trên môi trường PDA với
nồng độ nano bạc 10 ppm và bổ sung chitosan ở các nồng độ 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%. Cắt một mảnh nấm thuần Macrophoma theicola có kích thước 2 × 2 mm từ rìa của
Quả quýt
Phát hiện nấm
Thu sợi nấm
Nuôi cấy trong môi trường PDA
Phân lập trong môi trường PDA
Nấm thuần
tản nấm sau 3 ngày nuôi cấy ở 28°C đặt vào tâm các đĩa petri (Ф 9cm). Mỗi nồng độ
khảo sát được lặp lại 3 lần. Sử dụng thước kẹp điện tử để đo đường kính tản nấm (ĐKTN) mỗi ngày một lần. Tính kháng nấm của chế phẩm được thể hiện bằng sự ức chế
hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [15].Sơ đồ khảo sát tính
kháng nấmở điều kiện in vitro được trình bày ở Hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ởđiều kiện in vitro
2.2.2.2. Khảo sát ởđiều kiện in vivo
Quá trình thí nghiệm tiến hành tương tự như khảo sát khả năng kháng nấm được
phân lập theo điều kiện in vitro.
Quả quýt sau khi rửa sạch, được tạo 3 vết thương nhân tạo ở 3 vị trí khác nhau
trên quả quýt và gây bệnh bằng cách cho mỗi vết thương 10µl huyền phù nấm
Macrophoma theicola, nồng độ 106 tế bào/ml. Sau 2 giờ để khô ở điều kiện thường, nhúng 2 lần cách nhau 1 giờ chế phẩm nano bạc-Chi có nồng độ khác nhau (0%- mẫu đối chứng xử lý bằng nước cất; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%) rồi tiến hành theo dõi tỷ lệ
nhiễm bệnh trong 10 ngày và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh trên các quả gây nhiễm bệnh
nhân tạo. Mỗi nồng độ khảo sát được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ nhiễm bệnh (TLN) của quả quýt được xác định như sau: TLN (%) = (Tổng số vết thương phát triển nấm bệnh/Tổng số vết thương nhân tạo của mỗi công thức) × 100. (Ghi chú: Tổng số vết thương nhân tạo của
mỗi công thức = số vết thương nhân tạo/quả × số quả/mẫu = 3 × 5 =15) [15], [26]. Gia nhiệt Đổ đĩa Cấy nấm Nấm thuần Nuôi nấm Khảo sát tính kháng khuẩn Môi trường PDA Dung dịch nano bạc-Chi Khảo sát nồng độ (0% - 8%)
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát tính kháng nấm ởđiều kiện in vivo
Khảo sát tính kháng nấm
Bảo quản ở điều kiện thường trong 10 ngày
Để khô trong 1 giờ
Quýt sau thu hoạch
Rửa sạch Cấy nấm Huyền phù nấm Macrophoma theicola Nhúng chế phẩm nano bạc-Chi lần 1 (0% - 0,8%) trong 60 giây
Để khô ở điều kiện thường (2 giờ) Nhúng chế phẩm nano bạc-Chi lần 2 (0% - 0,8%) trong 60 giây Để khô trong 1 giờ Tạo vết thương
2.2.3. Ứng dụng bảo quản quýt (Citrus deliciosa) Hương Cần bằng chế phẩm nano bạc-Chi bạc-Chi
Trên cơ sở tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tác giả [5], [7], [13], [23] kết
hợp kế thừa quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc của nhóm nghiên cứu của TS. Võ Văn
Quốc Bảo chúng tôi đưa ra sơ đồ tóm tắt ở Hình 2.4 như sau:
Hình 2.4. Sơ đồứng dụng bảo quản quýt Hương Cần (Citrus deliciosa) bằng chế phẩm nano bạc-Chi [31] Phối trộn Chitosan Khuấy từ, gia nhiệt Chế phẩm nano bạc-Chi (0,2%-0,8%) Dung dịch nano bạc Nhúng trong 60 giây Quýt Hương Cần
Khảo sát hao hụt khối lượng tự nhiên; tỷ lệ hư hỏng; Hàm lượng
vitamin C; hàm
lượng đường; hàm
lượng acid; giá trị
cảm quan.
Bảo quản Làm sạch
Để khô ở điều kiện thường 1 giờ
Nhiệt độ 130C,
độ ẩm 80%-95%
Nhúng trong 60 giây
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc 2.3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc
- Chuẩn bị mẫu cần phân lập
Quýt bị nhiễm nấm bệnh được thu hái trên cây tại thôn Giáp Kiền, xã Hương
Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huếđem về phòng thí nghiệm để phân lập.
Chế phẩm nano bạc-Chi được chuẩn bị bằng phương pháp tổng hợp các hạt nano bạc
nhờ công nghệ siêu âm ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 phút từ dung dịch bạc nitrat với
dịch chiết xuất từ rau má tươi (centella asiatia) [23]. Tiếp theo cho chitosan vào dung dịch nano bạc trên máy khuấy từ với tốc độ 50 vòng/phút để chế tạo chế phẩm nano
bạc-Chi với các nồng độ tương ứng.
- Pha môi trường, dụng cụ phân lập và cách tiến hành được trình bày cụ thể ở
phụ lục 1.
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu tại vườn
Phương pháp lấy mẫu được thực hiện bằng phương pháp cảm quan chọn những
quả quýtđồng đều về kích thước, có bề mặt quả không bị rầy, không có dấu hiệu nhiễm
nấm, sâu gây bệnh và đạt độ chín thu hái thể hiện ở những đặc điểm như vỏ quả chuyển
từ màu xanh non sang xanh đều, kích thước và độ cứng quả đồng đều, vỏ quả nhẵn bóng,
căng mọng, đầu lún phồng, cuống quả lõm theo tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp
thử- xuất khẩu các loại quả có múi, TCVN 1873: 2014 [14].
Quýt được cắt cuống bằng kéo, xếp vào thùng carton có đệm lót.Sau đó được vận
chuyển ngay về phòng thí nghiệm khoa Cơ khí - Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế trong thời gian ngắn nhất.
2.3.2.2. Phương pháp lấy mẫu tại phòng thí nghiệm
Quýt sau khi đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân loại theo tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 1873: 2014 [14], loại bỏ những quả không đủ tiêu chuẩn và cắt tỉa cuống.
Chiều dài cuống sau khi cắt là 2 – 3 mm. Sau đó rửa sạch quả, lau khô và tiến hành dùng
phương pháp chia chéo ngẫu nhiên để phân chia mẫu thành từng lô thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các mẫu bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc kết hợp chitosan đến những biến đổi sinh lý, sinh hóa của quả trong thời gian bảo quản thể hiện trong sơ đồ Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thuyết minh quy trình được giới thiệu ở phụ lục 2.
Chitosan Nano bạc Phối trộn, khuấy từ CT3 ĐC CT1 CT2 Phân loại, làm sạch Quýt Vào thùng CT4 Bảo quản 130C Độ ẩm 80% -95% Chế phẩm nano bạc-Chi (0,2%; 0,4%;0,6%; 0,8%) Nhúng lần 1, lần 2 Để ráo 1 giờ
Bố trí các công thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nồng độ của chế phẩm nano bạc-Chi ứng với công thức bố trí thí nghiệm
Công thức thí nghiệm Chitosan 2% (ml) Nano bạc 50 ppm (ml) Nước cất (ml) Chế phẩm nano bạc-Chi (ml) Đối chứng (ĐC) 0 0 0 0 Công thức 1 (CT1) 30 60 210 300 (0,2%; 10 ppm) Công thức 2 (CT2) 60 60 180 300 (0,4%; 10 ppm) Công thức 3 (CT3) 90 60 150 300 (0,6%; 10 ppm) Công thức 4 (CT4) 120 60 120 300 (0,8%; 10ppm)
Các mẫu được bố trí trên cùng một diện tích và tiến hành xử lý cùng một thời điểm. Cứ sau 5 ngày theo dõi, lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu vật lý, sinh hóa của quýt và quá trình theo dõi kết thúc cho đến khi quả có triệu chứng hư hỏng≤ 10%. Quả quýt Hương Cầnđược bảo quản trong các thùng carton đục lỗ và bảo quản ở nhiệt độ 130C,
độ ẩm80% đến 95%. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi chỉ tiêu tiến
hành phân tích lặp 3 lần.
2.3.4. Phương pháp vật lý
2.3.4.1. Xác định hao hụt khối lượng tự nhiên của quả
Nguyên tắc: Sau khi thu hoạch các quá trình biến đổi trong quả diễn ra mạnh mẽ trong đó có quá trình bay hơi nước và tổn hao các chất hữu cơ khi hô hấp làm tổn thất khối lượng tựnhiên. Đểxác định tỷ lệ hao hụt của quả dùng phương pháp cân để xác định khối lượng quýt hao hụt theo thời gian bảo quản so với khối lượng quả ban
đầu. Thiết bịđược sử dụng là cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g [6], [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.1
Quả được xem bị hư hỏng là những quả có dấu hiệu bị nấm mốc, chớm thối hoặc
có những vết thương đen trên thân quả đến mức không phù hợp cho sử dụng (TCVN 1873: 2014). Để xác định tỷ lệ hư hỏng quả ta dùng cách đếm số quả bị hỏng trên tổng số
quả và diện tíchhư hỏng của quả [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.2.
2.3.5. Phương pháp hóa sinh
2.3.5.1. Xác định hàm lượng đường tổng số
Hàm lượng đường tổng số được xác định theo phương pháp Bertrand, nguyên tắc
chung của phương pháp này là dựa vào khả năng oxy hóa khử giữa đường khử với ion
kim loại trong môi trường có tính kiềm [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3,
mục 3.3.
2.3.5.2. Xác định hàm lượng vitamin C
Nguyên tắc: Trong quả quýt có chứa nhiều vitamin C, tham gia phản ứng oxy hóa
khử. Trong phân tử acid ascorbic chứa nhóm dienol (-HOC=COH-)CO có tính khử
mạnh nên có thể khử dung dịch iod. Phương trình phản ứng:
C6H8O6 + I2 C6H6O6 + HI
acid ascorbic acid dehydroascorbic
Hàm lượng vitamin C được xác định theo phương pháp chuẩn độ với iod 0,01N
với chỉ thị hồ tinh bột [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.4.
2.3.5.3. Xác định hàm lượng acid tổng số
Nguyên tắc: acid tổng số có trong nguyên liệu có thểđịnh lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu. Những acid chủ yếu này là acid hữu cơ như acid acetic, acid malic, acid citric, acid lactic…Từ lượng kiềm
tiêu hao ta tính được lượng acid tổng số có trong mẫu.
Hàm lượng acid trong quýt được xác định theo phương pháp trung hòa bằng NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3,
mục 3.5.
2.3.6. Phương pháp đánh giá cảm quan [11]
Quýt trong quá trình bảo quản, các tính chất cảm quan như màu sắc, mùi vị,...sẽ
bịthay đổi. Vì vậy, phương pháp cảm quan là rất quan trọng trong việc đánh giá chất
lượng sản phẩm và nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng.
mùi, vị. Người thử sẽ đánh giá mức độ ưa thích của mình đối với các mẫu trên thang điểm từ 1 đến 9 như sau:
Cực kỳ không thích: 1
Rất không thích: 2
Không thích: 3
Tương đối không thích: 4
Không thích cũng không ghét: 5
Tương đối thích: 6
Thích: 7
Rất thích: 8
Cực kỳ thích: 9
Điểm trung bình của tất cả các người thử chính là kết quả.
Mẫu phiếu đánh giá cảm quan được thể hiện ở phụ lục 4
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai nhân tố ANOVA và kiểm định LSD (5%) để so sánh sự khác biệt trung bình giữa các nghiệm thức cũng như sự biến động giữa các lần lặp lại trong cùng nghiệm thức theo thời gian. Xử lý thống kê số liệu
thực nghiệm sử dụng phần mềm tiêu chuẩn SPSS 20. Kết quả xử lý thể hiện ở phần phụ
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH NẤM TỪ QUẢ QUÝT HƯƠNG CẦN 3.1.1. Phân lập nấm
Nấm bệnh gây hại xuất hiện bên ngoài vỏ quả quýt trên cây và trong thời gian bảo
quản quýt làm cho quả quýt bị mốc, có hình thái sợ nấm màu trắng, xốp.
Dùng que kẹp vô trùng lấy các mẫu nấm bên ngoài vỏ quả quýt sang môi trường
PDA và nuôi ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.1. Nấm bệnh trên quả quýt Hương Cần
Sau 2 ngày, phân lập được 6 mẫu nấm (ký hiệu QB1, QB2, QB3, QB4, QB5,
QB6) từ các quả quýt Hương cần bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, cả 6 mẫu nấm đều có màu sắc, hình thái giống nhau. Nấm sau khi phân lập, ban đầu sợi nấm mẹ thưa, có màu trắng
dần dần chuyển sang màu tro, phân tán đều theo hướng thành đĩa peptri. Các sợi nấm
mọc hướng lên trên, bản nấm xốp và có kích thước 1 - 3mm. Tuy chúng tôi phân lập được 6 mẫu nấm nhưng hình thái bên ngoài giống nhau và khi định danh bằng phương
pháp giải trình tự ITS đều có kết quả như nhau. Vì vậy, kết quả phân lập chỉ giới thiệu
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của nấm bệnh ở quả quýt Hương Cần trên môi trường PDA
3.1.2. Định danh nấm
Các mẫu nấm sau khi được phân lập và định danh tại công ty TNHH Dịch vụ và
Thương mại Nam Khoa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, thành phố
Hồ Chí Minh, Việt Nam bằng phương pháp giải trình tựITS, trình tự nucleotide của 6
mẫu nấm giống nhau và được trình bày ở Hình 3.3
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gene của chủng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần
Tra cứu trên BLAST search (NCBI)
Hình 3.4. Kết quả tra cứu bằng công cụ BLAST search (NCBI)
Việc so sánh trình tự gene rRNA 28S của 6 mẫu nấm bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, trình tự gene tương đồng đến 100% với chủng Macrophoma theicola.
Kết quảnày đã cho phép kết luận rằng 6 mẫu nấm là loài Macrophoma theicola. Để
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn một mẫu nấm và ký hiệu
Macrophoma theicola: nấm được phát hiện đầu tiên trên cây chè, có khả năng
làm giảm sản lượng và làm ảnh hưởng rất lớn đến kinh tế sản xuất ngành chè [25].
- Phân loại khoa học [44]: + Ngành : Ascomycota. + Lớp : Dothideomycetes.
+ Phân lớp: Incertae sedis.
+ Bộ: Botryosphaeriales.
+ Họ: Botryosphaeriaceae.
+ Giống: Macrophoma.
+ Loài: Macrophoma theicola.
- Đặc điểm sinh học của Macrophoma theicola
Macrophoma theicola lây lan dễ dàng trong điều kiện mưa, ẩm ướt. Nhiệt độ tăng trưởng là 28 – 340C, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 320C. Macrophoma theicola phát triển ở
trên nhánh, lá và quả. Trên lá làm héo nhanh chóng, cuối cùng lá khô, rụng lá. Trên nhánh hình thành các vết loét, vết bệnh lõm (nhiều nơi gọi là loét cành). Nếu bệnh trên quả làm cho quả bị mốc trắng và mất nước cho đến quả khô [25]. Tại các nhà vườn ở xã
Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, các hộ trồng quýt cũng mô tả
những hiện tượng của nấm bệnh như trên.
Qua quá trình tham khảo, chưa có đề tài nào công bố liên quan đến nấm này trên
đối tượng quả có múi nói chung và đối tượng quả quýt nói riêng mà chỉ ghi nhận xuất
hiện và gây bệnh trên đối tượng chè. Với kết quả từ việc phân lập, định danh cho thấy có