3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc
- Chuẩn bị mẫu cần phân lập
Quýt bị nhiễm nấm bệnh được thu hái trên cây tại thôn Giáp Kiền, xã Hương
Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huếđem về phòng thí nghiệm để phân lập.
Chế phẩm nano bạc-Chi được chuẩn bị bằng phương pháp tổng hợp các hạt nano bạc
nhờ công nghệ siêu âm ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 phút từ dung dịch bạc nitrat với
dịch chiết xuất từ rau má tươi (centella asiatia) [23]. Tiếp theo cho chitosan vào dung dịch nano bạc trên máy khuấy từ với tốc độ 50 vòng/phút để chế tạo chế phẩm nano
bạc-Chi với các nồng độ tương ứng.
- Pha môi trường, dụng cụ phân lập và cách tiến hành được trình bày cụ thể ở
phụ lục 1.
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu tại vườn
Phương pháp lấy mẫu được thực hiện bằng phương pháp cảm quan chọn những
quả quýtđồng đều về kích thước, có bề mặt quả không bị rầy, không có dấu hiệu nhiễm
nấm, sâu gây bệnh và đạt độ chín thu hái thể hiện ở những đặc điểm như vỏ quả chuyển
từ màu xanh non sang xanh đều, kích thước và độ cứng quả đồng đều, vỏ quả nhẵn bóng,
căng mọng, đầu lún phồng, cuống quả lõm theo tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp
thử- xuất khẩu các loại quả có múi, TCVN 1873: 2014 [14].
Quýt được cắt cuống bằng kéo, xếp vào thùng carton có đệm lót.Sau đó được vận
chuyển ngay về phòng thí nghiệm khoa Cơ khí - Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế trong thời gian ngắn nhất.
2.3.2.2. Phương pháp lấy mẫu tại phòng thí nghiệm
Quýt sau khi đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân loại theo tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 1873: 2014 [14], loại bỏ những quả không đủ tiêu chuẩn và cắt tỉa cuống.
Chiều dài cuống sau khi cắt là 2 – 3 mm. Sau đó rửa sạch quả, lau khô và tiến hành dùng
phương pháp chia chéo ngẫu nhiên để phân chia mẫu thành từng lô thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các mẫu bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc kết hợp chitosan đến những biến đổi sinh lý, sinh hóa của quả trong thời gian bảo quản thể hiện trong sơ đồ Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thuyết minh quy trình được giới thiệu ở phụ lục 2.
Chitosan Nano bạc Phối trộn, khuấy từ CT3 ĐC CT1 CT2 Phân loại, làm sạch Quýt Vào thùng CT4 Bảo quản 130C Độ ẩm 80% -95% Chế phẩm nano bạc-Chi (0,2%; 0,4%;0,6%; 0,8%) Nhúng lần 1, lần 2 Để ráo 1 giờ
Bố trí các công thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nồng độ của chế phẩm nano bạc-Chi ứng với công thức bố trí thí nghiệm
Công thức thí nghiệm Chitosan 2% (ml) Nano bạc 50 ppm (ml) Nước cất (ml) Chế phẩm nano bạc-Chi (ml) Đối chứng (ĐC) 0 0 0 0 Công thức 1 (CT1) 30 60 210 300 (0,2%; 10 ppm) Công thức 2 (CT2) 60 60 180 300 (0,4%; 10 ppm) Công thức 3 (CT3) 90 60 150 300 (0,6%; 10 ppm) Công thức 4 (CT4) 120 60 120 300 (0,8%; 10ppm)
Các mẫu được bố trí trên cùng một diện tích và tiến hành xử lý cùng một thời điểm. Cứ sau 5 ngày theo dõi, lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu vật lý, sinh hóa của quýt và quá trình theo dõi kết thúc cho đến khi quả có triệu chứng hư hỏng≤ 10%. Quả quýt Hương Cầnđược bảo quản trong các thùng carton đục lỗ và bảo quản ở nhiệt độ 130C,
độ ẩm80% đến 95%. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi chỉ tiêu tiến
hành phân tích lặp 3 lần.
2.3.4. Phương pháp vật lý
2.3.4.1. Xác định hao hụt khối lượng tự nhiên của quả
Nguyên tắc: Sau khi thu hoạch các quá trình biến đổi trong quả diễn ra mạnh mẽ trong đó có quá trình bay hơi nước và tổn hao các chất hữu cơ khi hô hấp làm tổn thất khối lượng tựnhiên. Đểxác định tỷ lệ hao hụt của quả dùng phương pháp cân để xác định khối lượng quýt hao hụt theo thời gian bảo quản so với khối lượng quả ban
đầu. Thiết bịđược sử dụng là cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g [6], [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.1
Quả được xem bị hư hỏng là những quả có dấu hiệu bị nấm mốc, chớm thối hoặc
có những vết thương đen trên thân quả đến mức không phù hợp cho sử dụng (TCVN 1873: 2014). Để xác định tỷ lệ hư hỏng quả ta dùng cách đếm số quả bị hỏng trên tổng số
quả và diện tíchhư hỏng của quả [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.2.
2.3.5. Phương pháp hóa sinh
2.3.5.1. Xác định hàm lượng đường tổng số
Hàm lượng đường tổng số được xác định theo phương pháp Bertrand, nguyên tắc
chung của phương pháp này là dựa vào khả năng oxy hóa khử giữa đường khử với ion
kim loại trong môi trường có tính kiềm [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3,
mục 3.3.
2.3.5.2. Xác định hàm lượng vitamin C
Nguyên tắc: Trong quả quýt có chứa nhiều vitamin C, tham gia phản ứng oxy hóa
khử. Trong phân tử acid ascorbic chứa nhóm dienol (-HOC=COH-)CO có tính khử
mạnh nên có thể khử dung dịch iod. Phương trình phản ứng:
C6H8O6 + I2 C6H6O6 + HI
acid ascorbic acid dehydroascorbic
Hàm lượng vitamin C được xác định theo phương pháp chuẩn độ với iod 0,01N
với chỉ thị hồ tinh bột [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3, mục 3.4.
2.3.5.3. Xác định hàm lượng acid tổng số
Nguyên tắc: acid tổng số có trong nguyên liệu có thểđịnh lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu. Những acid chủ yếu này là acid hữu cơ như acid acetic, acid malic, acid citric, acid lactic…Từ lượng kiềm
tiêu hao ta tính được lượng acid tổng số có trong mẫu.
Hàm lượng acid trong quýt được xác định theo phương pháp trung hòa bằng NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein [14]. Cách tiến hành được mô tả ở phụ lục 3,
mục 3.5.
2.3.6. Phương pháp đánh giá cảm quan [11]
Quýt trong quá trình bảo quản, các tính chất cảm quan như màu sắc, mùi vị,...sẽ
bịthay đổi. Vì vậy, phương pháp cảm quan là rất quan trọng trong việc đánh giá chất
lượng sản phẩm và nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng.
mùi, vị. Người thử sẽ đánh giá mức độ ưa thích của mình đối với các mẫu trên thang điểm từ 1 đến 9 như sau:
Cực kỳ không thích: 1
Rất không thích: 2
Không thích: 3
Tương đối không thích: 4
Không thích cũng không ghét: 5
Tương đối thích: 6
Thích: 7
Rất thích: 8
Cực kỳ thích: 9
Điểm trung bình của tất cả các người thử chính là kết quả.
Mẫu phiếu đánh giá cảm quan được thể hiện ở phụ lục 4
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được phân tích phương sai nhân tố ANOVA và kiểm định LSD (5%) để so sánh sự khác biệt trung bình giữa các nghiệm thức cũng như sự biến động giữa các lần lặp lại trong cùng nghiệm thức theo thời gian. Xử lý thống kê số liệu
thực nghiệm sử dụng phần mềm tiêu chuẩn SPSS 20. Kết quả xử lý thể hiện ở phần phụ
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH NẤM TỪ QUẢ QUÝT HƯƠNG CẦN 3.1.1. Phân lập nấm
Nấm bệnh gây hại xuất hiện bên ngoài vỏ quả quýt trên cây và trong thời gian bảo
quản quýt làm cho quả quýt bị mốc, có hình thái sợ nấm màu trắng, xốp.
Dùng que kẹp vô trùng lấy các mẫu nấm bên ngoài vỏ quả quýt sang môi trường
PDA và nuôi ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.1. Nấm bệnh trên quả quýt Hương Cần
Sau 2 ngày, phân lập được 6 mẫu nấm (ký hiệu QB1, QB2, QB3, QB4, QB5,
QB6) từ các quả quýt Hương cần bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, cả 6 mẫu nấm đều có màu sắc, hình thái giống nhau. Nấm sau khi phân lập, ban đầu sợi nấm mẹ thưa, có màu trắng
dần dần chuyển sang màu tro, phân tán đều theo hướng thành đĩa peptri. Các sợi nấm
mọc hướng lên trên, bản nấm xốp và có kích thước 1 - 3mm. Tuy chúng tôi phân lập được 6 mẫu nấm nhưng hình thái bên ngoài giống nhau và khi định danh bằng phương
pháp giải trình tự ITS đều có kết quả như nhau. Vì vậy, kết quả phân lập chỉ giới thiệu
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của nấm bệnh ở quả quýt Hương Cần trên môi trường PDA
3.1.2. Định danh nấm
Các mẫu nấm sau khi được phân lập và định danh tại công ty TNHH Dịch vụ và
Thương mại Nam Khoa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7, thành phố
Hồ Chí Minh, Việt Nam bằng phương pháp giải trình tựITS, trình tự nucleotide của 6
mẫu nấm giống nhau và được trình bày ở Hình 3.3
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gene của chủng nấm được phân lập từ quả quýt Hương Cần
Tra cứu trên BLAST search (NCBI)
Hình 3.4. Kết quả tra cứu bằng công cụ BLAST search (NCBI)
Việc so sánh trình tự gene rRNA 28S của 6 mẫu nấm bằng công cụ BLAST trên NCBI cho thấy, trình tự gene tương đồng đến 100% với chủng Macrophoma theicola.
Kết quảnày đã cho phép kết luận rằng 6 mẫu nấm là loài Macrophoma theicola. Để
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn một mẫu nấm và ký hiệu
Macrophoma theicola: nấm được phát hiện đầu tiên trên cây chè, có khả năng
làm giảm sản lượng và làm ảnh hưởng rất lớn đến kinh tế sản xuất ngành chè [25].
- Phân loại khoa học [44]: + Ngành : Ascomycota. + Lớp : Dothideomycetes.
+ Phân lớp: Incertae sedis.
+ Bộ: Botryosphaeriales.
+ Họ: Botryosphaeriaceae.
+ Giống: Macrophoma.
+ Loài: Macrophoma theicola.
- Đặc điểm sinh học của Macrophoma theicola
Macrophoma theicola lây lan dễ dàng trong điều kiện mưa, ẩm ướt. Nhiệt độ tăng trưởng là 28 – 340C, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 320C. Macrophoma theicola phát triển ở
trên nhánh, lá và quả. Trên lá làm héo nhanh chóng, cuối cùng lá khô, rụng lá. Trên nhánh hình thành các vết loét, vết bệnh lõm (nhiều nơi gọi là loét cành). Nếu bệnh trên quả làm cho quả bị mốc trắng và mất nước cho đến quả khô [25]. Tại các nhà vườn ở xã
Hương Toàn, thị xã Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế, các hộ trồng quýt cũng mô tả
những hiện tượng của nấm bệnh như trên.
Qua quá trình tham khảo, chưa có đề tài nào công bố liên quan đến nấm này trên
đối tượng quả có múi nói chung và đối tượng quả quýt nói riêng mà chỉ ghi nhận xuất
hiện và gây bệnh trên đối tượng chè. Với kết quả từ việc phân lập, định danh cho thấy có
thể xảy ra sự biến thể và thích nghi với môi trường khác đối với loại nấm này, và cũng từ
kết quả này có thể làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo đối với loại nấm
Macrophoma theicola trên đối tượng cây có múi để đề ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu.
3.2. KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM ĐÃ ĐƯỢC ĐỊNH DANH BỞI CHẾ PHẨM NANO BẠC-CHI NANO BẠC-CHI
Sau khi khảo sát hiệu quả khả năng kháng loại nấm mới gây bệnh trên quả quýt Hương Cần, Macrophoma theicola ở điều kiện in vitro và in vivo. Để tăng hiệu quả ứng
dụng, chúng tôi sử dụng chế phẩm này để xử lý quả quýt sau thu hoạch với các nồng độ
khác nhau nhằm kéo dài thời gian bảo quản. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung
khảo sát sự ảnh hưởng của chế phẩm nano bạc-Chi đến các thành phần hóa học như hàm lượng vitamin C, acid tổng số, đường tổng số cũng như sự hao hụt khối lượng và tỷ lệ hư
3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vitro
Tính kháng khuẩn của chế phẩm được thể hiện bằng sự ức chế, hoặc tiêu diệt khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Vì vậy, dựa vào sự phát triển sợi nấm trên đĩa thạch, có
thể xác định được tính kháng khuẩn của chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan đối với
nấm cần nghiên cứu.
Sau 6 ngày theo dõi khả năng kháng nấm Macrophoma theicola QB1 trên môi
trường PDA có sử dụng chế phẩm nano bạc bổ sung chitosan với các nồng độ khác nhau
(0%- đối chứng; 0,2%; 0,4%; 0,6% và 0,8%) và các ký hiệu tương ứng: mẫu 1; mẫu 2;
mẫu 3; mẫu 4 và mẫu 5; kết quả thể hiện qua Hình 3.5 và Bảng 3.1.
Mẫu 1 Mẫu 2
Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nano bạc-Chi đến khảnăng sinh trưởng tản nấm Macrophoma theicola QB1 sau 6 ngày theo dõi
Nồng độ nano bạc-Chi (%)
Đường kính tản nấm (cm)
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày
0 2,5cA 4,9cB 8,6cC 8,6cC 8,6cC 8,6cC
0,2 0,3bA 0,5bB 0,9bC 0,9bC 0,8bC 0,9bC
0,4 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
0,6 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
0,8 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA 0,0aA
Ghi chú: Các chữ cái thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95 %, trong đó a, b, c theo hàng cột và A, B, C theo hàng ngang.
Số liệu ở Bảng 3.1 cho thấy tất cả các mẫu có xử lý bằng nano bạc-Chi đều có ảnh hưởng sự phát triển của đường kính tản nấm. Đường kính tản nấm giảm dần khi nồng độ
chế phẩm nano bạc-Chi tăng lên. Ở mẫu 1 (ĐC), sau 1 ngày đã xuất hiện sợi nấm màu trắng, mọc tỏa theo hình tròn hướng về thành đĩa petri, ĐKTN trung bình 2,5 cm. Sau 3
ngày, lượng nấm phát triển nhiều hơn và tràn đầy mặt đĩa và sau 6 ngày sợi nấm chuyển sang giai đoạn già hóa nên chuyển sang màu tro xám. Đường kính tản nấm trung bình ở
mẫu 2là 0,3 cm; 0,5 cm và 0,9 cm tương ứng sau 1 , 2 và 3 ngày theo dõi, từ ngày thứ 4 không tăng, sợi nấm không phát triển và bắt đầu bị già hóa. Ở các mẫu còn lại tương ứng
với nồng độ nano bạc-Chi 0,4; 0,6 và 0,8 %, sự sinh trưởng của nấm bị ức chế hoàn toàn
ở ngày đầu tiên.
Trong điều kiện in vitro, khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh Macrophoma theicola, Võ Văn Quốc Bảo và cs (2018). cho thấy các hạt nano bạc đã thể hiện tác dụng ức chế đối với nấm này đối với chế phẩm nano bạc-TBS ở nồng độ 10 ppm và có hiệu
quả ức chế hoàn toàn sự phát triển nấm từ nồng độ 30 ppm [1]. Cơ chế tác dụng của nano
bạc đối với nấm được đánh giá ở các nồng độ khác nhau, gây tổn thương trực tiếp đến
màng tế bào, ức chế quá trình nhân đôi DNA và vô hiệu hóa các enzyme dẫn đến ức chế
và tiêu diệt sự phát triển của nấm [15], [19], [27]. Như vậy, kết quả nghiên cứu khả năng
kháng nấm Macrophoma theicola QB1 của chế phẩm nano bạc – Chi tương đồng với
3.2.2. Khảo sát khả năng kháng nấm bởi chế phẩm nano bạc-Chi ở điều kiện in vivo
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 trên quả
quýt Hương Cần trong điều kiện in vivo ở Hình 3.6 cho thấy có sự ảnh hưởng của chế
phẩm nano bạc-Chi đến khả năng hạn chế nhiễm bệnh.
Hình 3.6. Tỷ lệ quả quýt bị nhiễm nấm bệnh Macrophoma theicola QB1 sau khi nhúng nano bạc-Chi ở các nồng độ khác nhau
Qua kết quả thể hiện ở Hình 3.6, tất cả các nồng độ xử lý, tỷ lệ kháng bệnh ở các
nồng độ xử lý chế phẩm nano bạc-Chi vượt trội so với đối chứng. Nồng độ của chitosan bổ sung vào dung dịch nano bạc càng cao, khả năng ức chế sinh trưởng của nấm bệnh
càng lớn, hiện tượng nhiễm bệnh xuất hiện tại các vết thương nhân tạo càng ít. Ở nồng độ chitosan 0,2%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 42,2%; 0,4%, tỷ lệ nhiễm bệnh là 17,8%; và từ
0,6% không thấy xuất hiện vết bệnh. Kết quả của Võ Văn Quốc Bảo và cs. khi khảo sát