2) Ý nghĩa thực tiễn
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH TIÊU CHẢY DO E COLI
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Có rất nhiều đề tài của các tác giải khác nhau đã triển khai nghiên cứu về vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy cho lợn, nuôi ở hầu hết các khu vực của nước ta (Đào Trọng Đạt và cs, 1995).
Đỗ Ngọc Thúy và cs (2002) đã xác định đặc tính kháng nguyên và vai trò gây bệnh của E. coli gây tiêu chảy ở lợn cho thấy, trong tổng số 170 chủng được kiểm tra, các chủng có mang tổ hợp các yếu tố gây bệnh F4/STa/STb/LT và thuộc serotype kháng nguyên O149:K91 là phổ biến nhất. Các chủng đại diện cho tổ hợp các yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên O đều biểu hiện đặc tính gây bệnh invitro và invivo điển hình.
Cũng trong thời gian đó, Hoàng Văn Hoan và cs (2004) đã nghiên cứu chế phẩm kháng sinh tổng hợp Enrofloxin để điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn mang lại hiệu quả điều trị cao. Ở lợn con theo mẹ từ 1 - 21 ngày tuổi tỷ lệ khỏi bệnh đạt trên
90%, thời gian điều trị từ 1,8 - 2,02 ngày, giá thành điều trị thấp 450 - 500đ/con. Cao hơn rõ rệt so với các loại thuốc cùng loại khác. Ở lợn tập ăn và sau cai sữa 22 - 60 ngày tuổi, chế phẩm Enroflocin cho tỷ lệ khỏi bệnh rất cao 90 - 100%.
Bằng phương pháp PCR, Vũ Khắc Hùng và cs (2005) xác định được tỷ lệ sinh độc tố STa, LT và VT2a lần lượt là 24%, 20%, 4,5% từ216 chủng lợn con sau cai sữa. Phần lớn các chủng sinh độc tố đều mang yếu tố bám dính.
Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Minh Trang và cs (2011) về sự nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên lợn con, tác giả cho biết vi khuẩn E. coli đề kháng gần như hoàn toàn với kháng sinh Tetracyclin (97,6%), đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng ở địa phương như: Amoxycllin, Enprofloxacin, Colistin, Gentamycin, Flofenycol và nhạy cảm mạnh với Imipeneme.
Nguyễn Anh Tuấn và cs (2013) cũng cho biết tỷ lệ phân lập E. coli từ mẫu phân của lợn con theo mẹ là 86,2%; từ mẫu phân lợn sau cai sữa là 78,0%. Trong các chủng phân lập từ lợn con theo mẹ, tỷ lệ các serotype O149, O101,O64 và O8 lần lượt là 48%; 20%; 12% và 8%. Tỷ lệ các serotyp thuộc các chủng phân lập từ lợn con sau cai sữa là O141 (43,7%), O139 (28,1%), O149 và O138 cùng chiếm 9,3%. Tỷ lệ các chủng E. coli phân lập từ lợn con theo mẹ mang gen mã hóa độc tố STa, STb, LT và các yếu tố bám dính F4, F18 là 32%; 44%; 24%; % và 32%. Ở nhóm chủng từ lợn con sau cai sữa, tỷ lệ tương ứng là 65,5; 21,8; 59,4; 0 và 34,3%. Các chủng E. coli phân lập được mẫn cảm cao với Apramycin, Cephalothin, Amikacin, Certiofur và kháng Tetramycin.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu nhiều về vi khuẩn E. coli từ rất lâu. Năm 1971 theo Niconxki thì khoảng 20 - 50% lợn con bị chết trong những ngày sơ sinh, đôi khi tỷ lệ chết lên tới 100%. Thiệt hại do nhiễm khuẩn E. coli còn tăng cao do con non quá ốm hoặc sử dụng thức ăn không hợp lý.
Nghiên cứu của Evans và cs (1973) cho thấy 42% số chủng E. coli phân lâp được từ đường tiết niệu và 29% số chủng E. coli phân lâp từ máu có khả năng gây dung huyết.
Đến năm 1978 Minshew và cộng sự đã phát hiện có 48% số chủng E. coli
phân lập được ở đường ruột có khả năng dung huyết, trong khi đó vi khuẩn E. coli
phân lập từ phân chỉ co 8 - 18% các chủng gây dung huyết.
Sokol và cs (1981) cũng cho biết sở dĩ vi khuẩn E. coli từ vai trò cộng sinh thường trực trong đường ruột trở thành vi khuẩn gây bệnh là vì trong quá trình sống
cá thể vi khuẩn tiếp nhận được các yếu tố gây bệnh mà theo ông đó là yếu tố gây dung huyết, yếu tố độc tố đường ruột, yếu tố cạnh tranh, yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố kháng sinh. Các yếu tố gây bệnh không được di truyền qua AND của chromosome (nhiễm sắc thể), mà di truyền bằng AND nằm ngoài chromosome được gọi là plasmid. Qua hiện tượng trao đổi di truyền bằng tiếp hợp, chính những yếu tố gây bệnh này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào được tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh là sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào niêm mạc ruột, tế bào nhung mao ruột non, từ đó gây dung huyết, nhiễm độc huyết.
Fairbrother (1992) khi nghiên cứu về các yếu gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, tác giả đã đặt tên các chủng vi khuẩn E. coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxngenic E. coli (ETEC); Enteropathogenic E. coli (EPEC); Verotoxigenic
E. coli (VTEC); Adhesive Enteropathogenic E. coli (AEEC). Từ đó sắp xếp các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây nên những thể bệnh đặc trưng cho từng lứa tuổi khác nhau ở lợn.
1.5. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN LỢN Ở HUYỆN BỐ TRẠCH 1.5.1. Một số đặc điểm tự nhiên của huyện Bố Trạch 1.5.1. Một số đặc điểm tự nhiên của huyện Bố Trạch
Huyện Bố Trạch là một trong 8 huyện, thị xã, thành phố của tỉnh Quảng Bình, có diện tích tự nhiên 2.123,1km2. Phía bắc giáp với thị xã Ba Đồn, huyện Tuyên Hóa, Minh Hóa; phía nam giáp với thành phố Đồng Hới, huyện Quảng Ninh; phía đông giáp với Biển Đông; phía tây có đường biên giới giáp với Cộng hòa Dân chủ nhân dân Lào. Huyện có đủ bốn loại địa hình (miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển) chính vì vậy có một số đặc điểm khí hậu đặc trưng của tỉnh Quảng Bình:
Nhiệt độ: theo số liệu thống kê cho thấy nhiệt độ trung bình năm giao động từ 24 - 24,60C; cao nhất vào tháng 6,7 giao động từ 29,5 - 300C; thấp nhất vào tháng giêng giao động 16 - 170C, khi có không khí lạnh tràn về với cường độ mạnh, nhiệt độ thấp nhất xuống dưới 100C, thậm chí có năm xuống 50C; khoảng giao động giữa tháng cao nhất và thấp nhất là 13,50
C; biên độ nhiệt trong ngày khá cao, về mùa hè từ 8- 90C, mùa đông 6 - 6,50
C.
Số giờ nắng trung bình/năm là 1.800 – 1.820 giờ, tháng có nhiều giờ nắng nhất là các tháng 5, 6, 7, 8 và tháng có ít giờ nắng nhất từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau.
Lượng mưa trung bình hàng năm 2.000 - 2.300mm. Thời gian mưa tập trung vào các tháng 9, 10 và 11. Ẩm độ trung bình năm là 81% và giao động trong khoảng 77 đến 89%.
Đặc điểm địa hình và khí hậu ở Quảng Bình khá thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật, trong đó có tác động đáng kể đến tình hình dịch bệnh trên đàn lợn nuôi, đặc biệt là bệnh tiêu chảy.
1.5.2. Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn
Trong những năm gần đây, cùng với khoa học phát triển, chế độ chính sách ưu đãi của huyện, cũng như thực hiện chương trình tái cơ cấu ngành nông nghiệp giai đoạn 2015 – 2020 của tỉnh Quảng Bình. Vì vậy, chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện Bố Trạch phát triển khá, hiện tại có 18 trang trại chăn nuôi tập trung có quy mô 100 - 800 nái, gần 100 gia trại có quy mô 10-50 nái. Các trang trại, gia trại tập trung chủ yếu ở các xã ven biển và vùng bán sơn địa. Tổng đàn lợn là 111.600 con (Cục Thống kê Quảng Bình, 7/2015), chiếm 28,6% tổng đàn lợn toàn tỉnh và tăng 16,85% so với cùng kỳ năm 2014.
Song song với việc phát triển tổng đàn thì tình hình dịch bệnh trên đàn lợn cũng diễn biến khá phức tạp, gây tổn thương khá nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn. Tổng hợp báo cáo của Trạm Thú y huyện Bố Trạch từ năm 2010 đến năm 2015 cho thấy, có đến 9 loại bệnh thường xảy ra, nhưng chủ yếu là các bệnh tụ huyết trùng, dịch tả, tiêu chảy, suyễn, phó thương hàn, lở mồm long móng. Trong đó, bệnh có số lượng mắc và tần suất xuất hiện lớn nhất là bệnh tiêu chảy. Bệnh này xảy ra quanh năm, tỷ lệ mắc rất cao chiếm 62% (21.321/35.535) trong tổng số ca bệnh của lợn và tỷ lệ chết khá thấp chỉ 4,7%. Tuy nhiên, khi lợn bị tiêu chảy, ngoài việc chi phí cho điều trị, số lợn khỏi bệnh cũng chậm lớn, tiêu tốn thức ăn tăng, làm tăng chi phí trong chăn nuôi, dẫn đến chăn nuôi kém hiệu quả. Mặt khác, việc sử dụng kháng sinh nhiều, không khoa học trong điều trị, gây tồn dư kháng sinh là một trong những nguyên nhân làm thực phẩm không an toàn, là mối nguy hại cho sức khỏe con người.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi tại một số trang trại và hộ chăn nuôi trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm lấy mẫu: bệnh phẩm là các mẫu phân lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy tại các trang trại, gia trại, hộ chăn nuôi trên địa bàn 8 xã của huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình: Đại Trạch, Trung Trạch, Phúc Trạch, Hòa Trạch, Hoàn Trạch, Nhân Trạch, Mỹ Trach và Nam Trạch.
Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm Vi trùng – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông – Lâm Huế.
Địa điểm điều trị thực nghiệm: Trại Lợn Phương Hạ thuộc Trung tâm Giống vật nuôi tỉnh Quảng Bình (Thôn Phương Hạ, xã Đại Trạch, huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình).
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 08/2015 đến tháng 2/2016.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu phân tiêu chảy lợn con sau cai sữa; Giám định các đặc tính sinh vật và hóa học của vi khuẩn E. coli;
Xác định tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 của vi khuẩn E. coli
bằng phản ứng PCR;
Xác định tính mẫn cảm kháng sinh;
Thử nghiệm phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để có cơ sở cho quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành điều tra tình hình chăn nuôi, xác định các vùng theo điều kiện tự nhiên và điều tra tình hình bệnh tiêu chảy ở lợn trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình. Từ đó, chọn địa điểm lấy mẫu, số lượng mẫu đưa vào nghiên cứu. Quá trình nghiên cứu vi khuẩn E. coli
Sơ đồ nghiên cứu vi khuẩn E. coli Mẫu thí nghiệm EMB lỏng PCR Tỷ lệ mẫu mang gene bám dính F18 EMB agar Khuẩn lạc thuần khiết
Khuẩn lạc thuần khiết
kiểm tra sinh hóa, nhuộm Gram
Kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu trực tràng lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy, sau đó cho ngay vào túi nilon vô trùng, nhỏ thêm 0,5ml nước muối sinh lý NaCl 0,85%, buộc chặt, ghi ký hiệu mẫu (Nguyễn Xuân Hòa và cs, 2009).
Mỗi đàn (ổ lợn) chỉ lấy một mẫu bệnh phẩm. Mẫu được bảo quản ở điều kiện 2-40
C, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm.
2.3.2. Phân lập vi khuẩn
2.3.2.1. Phương pháp xác định tính chất nuôi cấy
Các mẫu vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trên môi trường EMB (có agar và không agar), nước thịt, quan sát tính chất mọc của vi khuẩn trên các loại môi trường.
2.3.2.2. Phương pháp xác định hình thái vi khuẩn
Các mẫu vi khuẩn sau khi phân lập được nhuộm Gram và xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn E. coli là những trực khuẩn nhỏ bắt màu Gram âm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn.
Phương pháp nhuộm Gram:
Cách pha thuốc nhuộm theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006): - Dung dịch tím violet: Crystal violet 2 g Cồn 90º 20 ml Amonium oxalat 0,8 g Nước cất 80 ml
Cách pha chế: nghiền Crystal trong cồn 90º và nghiền amonium oxalat trong nước cất, trộn hai hỗn hợp lại với nhau lọc qua giấy lọc ta được thuốc nhuộm violet.
- Dung dịch fucshin:
Fucsin base 1 g Etanol 96º 10 ml
Phenol 5 g Nước cất 1000 ml
Cách pha chế: nghiền fucsin với 5 ml etanol quấy đều, đổ 2/3 lượng nước cất vào, quấy đều xong cho phenol vào, đem lọc qua giấy lọc và tráng cốc bằng 1/3 nước cất và 1/2 etanol còn lại.
- Dung dịch lugol:
Iot 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml
Cách pha chế: nghiền nhỏ KI và Iot với nhau, cho tiếp một lượng nước cất vào nghiền tiếp rùi lọc qua giấy lọc, cứ làm vậy cho hết 300 ml nước cất. Pha xong phải bảo quản trong chai tối màu.
- Dung dịch tẩy màu: cồn 96o
Cách nhuộm Gram:
Bước 1: Nhỏ dung dịch tím kết tinh lên tiêu bản để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy nước đi. Bước 3: Tẩy màu bằng cồn nguyên chất hoặc cồn axeton từ đầu phiến kính, nghiêng phiến khính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 4: Nhuộm bổ sung dung dịch fucsin loãng để 1 phút, rửa nước, vẩy khô nước. Thấm khô phiến kính, xem dưới vật kính dầu × 100. Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.
2.3.3. Giám định các đặc tính sinh vật và hóa học của vi khuẩn E. coli
Tiến hành xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E. coli trên 7 môi trường sinh hóa, theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006).
2.3.3.1. Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra ria đều trên phần thạch nghiêng và cấy chích sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 37 °C sau 18 – 24 giờ thì đọc kết quả. Trong môi trường KIA cho phép xác định được 4 tính chất:
Khả năng lên men đường glucose: vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đứng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng là dương tính và ngược lại, vi khuẩn không có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đứng giữ nguyên màu đỏ là âm tính.
Khả năng lên men đường lactose: vi khuẩn lên men đường lactose sẽ làm phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng là dương tính và ngược lại không đổi màu là âm tính.
Khả năng sinh hơi: vi khuẩn có khả năng sinh hơi làm thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên khỏi đáy ống nghiệm; trường hợp sinh hơi yếu, trong lòng thạch có các bọt khí.
Khả năng sinh H2S: vi khuẩn có khả năng sản sinh H2S thì phần thạch đứng có màu đen. Do H2S được hình thành từ các axít amin chứa lưu huỳnh có trong peptone hoặc từ Sodium thiosulphate (Na2S2O3) có trong môi trường. H2S phản ứng với FeSO4 (Ferrous Ammonium Sulphate) theo phản ứng sau:
H2S + FeSO4 = FeS (đen) + H2SO4
2.3.3.2. Kiểm tra sinh hóa trên môi trường MUI
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường trích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37 °C từ 18 – 24 giờ sau đó đọc kết quả. Môi trường này cho phép xác định được 3 tính chất:
Khả năng di động: vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều; vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy.
Vi khuẩn có enzyme urease sẽ phân giải urê thành NH3 và làm pH của môi trường thay đổi, khi đó chất chỉ thị màu Phenol red chuyển môi trường sang màu cánh sen.
Tiến hành thử Indol: trong môi trường MUI có chứa tryptophan là một amino axít, một số vi khuẩn có men tryptophanaza phân giải tryptophan sinh Indol. Khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào môi trường Urease – Indol có cấy vi khuẩn có khả năng phân giải tryptophan sinh Indol thì trên bề mặt môi trường sẽ xuất hiện vòng màu đỏ.
2.3.4. Phương pháp xác định gene sản sinh kháng nguyên bám dính F18
2.3.4.1. Chuẩn bị mạch khuôn từ mẫu vật