2) Ý nghĩa thực tiễn
1.5.2. Tình hình dịch bệnh trên đàn lợn
Trong những năm gần đây, cùng với khoa học phát triển, chế độ chính sách ưu đãi của huyện, cũng như thực hiện chương trình tái cơ cấu ngành nông nghiệp giai đoạn 2015 – 2020 của tỉnh Quảng Bình. Vì vậy, chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện Bố Trạch phát triển khá, hiện tại có 18 trang trại chăn nuôi tập trung có quy mô 100 - 800 nái, gần 100 gia trại có quy mô 10-50 nái. Các trang trại, gia trại tập trung chủ yếu ở các xã ven biển và vùng bán sơn địa. Tổng đàn lợn là 111.600 con (Cục Thống kê Quảng Bình, 7/2015), chiếm 28,6% tổng đàn lợn toàn tỉnh và tăng 16,85% so với cùng kỳ năm 2014.
Song song với việc phát triển tổng đàn thì tình hình dịch bệnh trên đàn lợn cũng diễn biến khá phức tạp, gây tổn thương khá nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn. Tổng hợp báo cáo của Trạm Thú y huyện Bố Trạch từ năm 2010 đến năm 2015 cho thấy, có đến 9 loại bệnh thường xảy ra, nhưng chủ yếu là các bệnh tụ huyết trùng, dịch tả, tiêu chảy, suyễn, phó thương hàn, lở mồm long móng. Trong đó, bệnh có số lượng mắc và tần suất xuất hiện lớn nhất là bệnh tiêu chảy. Bệnh này xảy ra quanh năm, tỷ lệ mắc rất cao chiếm 62% (21.321/35.535) trong tổng số ca bệnh của lợn và tỷ lệ chết khá thấp chỉ 4,7%. Tuy nhiên, khi lợn bị tiêu chảy, ngoài việc chi phí cho điều trị, số lợn khỏi bệnh cũng chậm lớn, tiêu tốn thức ăn tăng, làm tăng chi phí trong chăn nuôi, dẫn đến chăn nuôi kém hiệu quả. Mặt khác, việc sử dụng kháng sinh nhiều, không khoa học trong điều trị, gây tồn dư kháng sinh là một trong những nguyên nhân làm thực phẩm không an toàn, là mối nguy hại cho sức khỏe con người.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi tại một số trang trại và hộ chăn nuôi trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm lấy mẫu: bệnh phẩm là các mẫu phân lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy tại các trang trại, gia trại, hộ chăn nuôi trên địa bàn 8 xã của huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình: Đại Trạch, Trung Trạch, Phúc Trạch, Hòa Trạch, Hoàn Trạch, Nhân Trạch, Mỹ Trach và Nam Trạch.
Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm Vi trùng – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông – Lâm Huế.
Địa điểm điều trị thực nghiệm: Trại Lợn Phương Hạ thuộc Trung tâm Giống vật nuôi tỉnh Quảng Bình (Thôn Phương Hạ, xã Đại Trạch, huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình).
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 08/2015 đến tháng 2/2016.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu phân tiêu chảy lợn con sau cai sữa; Giám định các đặc tính sinh vật và hóa học của vi khuẩn E. coli;
Xác định tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 của vi khuẩn E. coli
bằng phản ứng PCR;
Xác định tính mẫn cảm kháng sinh;
Thử nghiệm phác đồ điều trị tiêu chảy cho lợn.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để có cơ sở cho quá trình nghiên cứu, chúng tôi tiến hành điều tra tình hình chăn nuôi, xác định các vùng theo điều kiện tự nhiên và điều tra tình hình bệnh tiêu chảy ở lợn trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình. Từ đó, chọn địa điểm lấy mẫu, số lượng mẫu đưa vào nghiên cứu. Quá trình nghiên cứu vi khuẩn E. coli
Sơ đồ nghiên cứu vi khuẩn E. coli Mẫu thí nghiệm EMB lỏng PCR Tỷ lệ mẫu mang gene bám dính F18 EMB agar Khuẩn lạc thuần khiết
Khuẩn lạc thuần khiết
kiểm tra sinh hóa, nhuộm Gram
Kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu trực tràng lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy, sau đó cho ngay vào túi nilon vô trùng, nhỏ thêm 0,5ml nước muối sinh lý NaCl 0,85%, buộc chặt, ghi ký hiệu mẫu (Nguyễn Xuân Hòa và cs, 2009).
Mỗi đàn (ổ lợn) chỉ lấy một mẫu bệnh phẩm. Mẫu được bảo quản ở điều kiện 2-40
C, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm.
2.3.2. Phân lập vi khuẩn
2.3.2.1. Phương pháp xác định tính chất nuôi cấy
Các mẫu vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trên môi trường EMB (có agar và không agar), nước thịt, quan sát tính chất mọc của vi khuẩn trên các loại môi trường.
2.3.2.2. Phương pháp xác định hình thái vi khuẩn
Các mẫu vi khuẩn sau khi phân lập được nhuộm Gram và xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn E. coli là những trực khuẩn nhỏ bắt màu Gram âm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn.
Phương pháp nhuộm Gram:
Cách pha thuốc nhuộm theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006): - Dung dịch tím violet: Crystal violet 2 g Cồn 90º 20 ml Amonium oxalat 0,8 g Nước cất 80 ml
Cách pha chế: nghiền Crystal trong cồn 90º và nghiền amonium oxalat trong nước cất, trộn hai hỗn hợp lại với nhau lọc qua giấy lọc ta được thuốc nhuộm violet.
- Dung dịch fucshin:
Fucsin base 1 g Etanol 96º 10 ml
Phenol 5 g Nước cất 1000 ml
Cách pha chế: nghiền fucsin với 5 ml etanol quấy đều, đổ 2/3 lượng nước cất vào, quấy đều xong cho phenol vào, đem lọc qua giấy lọc và tráng cốc bằng 1/3 nước cất và 1/2 etanol còn lại.
- Dung dịch lugol:
Iot 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml
Cách pha chế: nghiền nhỏ KI và Iot với nhau, cho tiếp một lượng nước cất vào nghiền tiếp rùi lọc qua giấy lọc, cứ làm vậy cho hết 300 ml nước cất. Pha xong phải bảo quản trong chai tối màu.
- Dung dịch tẩy màu: cồn 96o
Cách nhuộm Gram:
Bước 1: Nhỏ dung dịch tím kết tinh lên tiêu bản để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy nước đi. Bước 3: Tẩy màu bằng cồn nguyên chất hoặc cồn axeton từ đầu phiến kính, nghiêng phiến khính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 4: Nhuộm bổ sung dung dịch fucsin loãng để 1 phút, rửa nước, vẩy khô nước. Thấm khô phiến kính, xem dưới vật kính dầu × 100. Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.
2.3.3. Giám định các đặc tính sinh vật và hóa học của vi khuẩn E. coli
Tiến hành xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn E. coli trên 7 môi trường sinh hóa, theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006).
2.3.3.1. Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra ria đều trên phần thạch nghiêng và cấy chích sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 37 °C sau 18 – 24 giờ thì đọc kết quả. Trong môi trường KIA cho phép xác định được 4 tính chất:
Khả năng lên men đường glucose: vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đứng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng là dương tính và ngược lại, vi khuẩn không có khả năng lên men đường glucose thì phần thạch đứng giữ nguyên màu đỏ là âm tính.
Khả năng lên men đường lactose: vi khuẩn lên men đường lactose sẽ làm phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng là dương tính và ngược lại không đổi màu là âm tính.
Khả năng sinh hơi: vi khuẩn có khả năng sinh hơi làm thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên khỏi đáy ống nghiệm; trường hợp sinh hơi yếu, trong lòng thạch có các bọt khí.
Khả năng sinh H2S: vi khuẩn có khả năng sản sinh H2S thì phần thạch đứng có màu đen. Do H2S được hình thành từ các axít amin chứa lưu huỳnh có trong peptone hoặc từ Sodium thiosulphate (Na2S2O3) có trong môi trường. H2S phản ứng với FeSO4 (Ferrous Ammonium Sulphate) theo phản ứng sau:
H2S + FeSO4 = FeS (đen) + H2SO4
2.3.3.2. Kiểm tra sinh hóa trên môi trường MUI
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường trích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37 °C từ 18 – 24 giờ sau đó đọc kết quả. Môi trường này cho phép xác định được 3 tính chất:
Khả năng di động: vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều; vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy.
Vi khuẩn có enzyme urease sẽ phân giải urê thành NH3 và làm pH của môi trường thay đổi, khi đó chất chỉ thị màu Phenol red chuyển môi trường sang màu cánh sen.
Tiến hành thử Indol: trong môi trường MUI có chứa tryptophan là một amino axít, một số vi khuẩn có men tryptophanaza phân giải tryptophan sinh Indol. Khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào môi trường Urease – Indol có cấy vi khuẩn có khả năng phân giải tryptophan sinh Indol thì trên bề mặt môi trường sẽ xuất hiện vòng màu đỏ.
2.3.4. Phương pháp xác định gene sản sinh kháng nguyên bám dính F18
2.3.4.1. Chuẩn bị mạch khuôn từ mẫu vật
Thực hiện theo mô tả của Nguyễn Xuân Hòa và cs (2010): Vi khuẩn E. coli
cấy vào môi trường LB lỏng sau 12 giờ thu sinh khối tiến hành tách DNA.
Bước 1: Hút 500 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn) cho vào ống Eppendorf tương ứng. Ly tâm ở 40C trong thời gian 3 phút với tốc độ 3000 vòng phút. Hút bỏ dịch nổi (giữ lại cặn chứa vi khuẩn).
Bước 2: Tiếp tục ly tâm gạn rửa 2 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85 %.
Bước 3: Tái huyền phù bằng nước cất 2 lần 200µl, cho vào ống Eppendorf đun cách thủy 950
C/3-5 phút. Bước 4: Ly tâm 40
C, tốc độ 4000 vòng/ phút. Hút 100µl nước mặt có chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR bảo quản ở 4 0
C.
2.3.4.2. Chuẩn bị mồi (primer)
Mồi là những đoạn oligonucleotid có độ dài từ 18 - 30 nucleotid với trình tự sắp xếp các nucleotid đã xác định. Các cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) được dùng để xác định một số yếu tố độc lực của E. coli có trình tự nucleotid do Công ty BioRadcung cấp. Thực hiện theo mô tả của Nguyễn Xuân Hòa và cs (2013).
Bảng 2.1. Các cặp mồi và trình tự các cặp mồi
Mồi Trình tự mồi Gen Kích cỡ
(bp)
F18-F 66-GCAAGGGGATGTTAAATTC-84
F18 447
F18-R 512-TTGTAAGTAACCGCGTAAG-494
2.3.4.3. Thành phần các phản ứng PCR
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn với các cặp mồi F18
TT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR Master Mix 5 2 Primer xuôi 0,25 3 Primer ngược 0,25 4 Nước cất 3,5 5 DNA khuôn 1 Tổng 10
2.3.4.4. Chương trình chạy PCR
Bảng 2.3. Chương trình chạy PCR đơn với các cặp mồi F18
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian (phút)
Giai đoạn 1 1 94 5 Giai đoạn 2 30 94 1 55 1 72 1 Giai đoạn 3 1 72 10
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm của chủng E. coli phân lập được đối với một số loại kháng sinh thường dùng lập được đối với một số loại kháng sinh thường dùng
Để hạn chế khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli và đưa ra biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả nhất, chúng tôi tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp của Quinn và cộng sự (1994). Từ những chủng vi khuẩn E. coli
dương tính với kháng nguyên bám dính F18, chúng tôi tiến hành kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh.
Bảng 2.4. Trích bảng tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh (NCCLS – 2007)
Kháng sinh
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Cefotaxim ≤ 29 29-35 ≥35 Streptomycin ≤ 12 12-20 ≥20 Gentamycin ≤ 19 19-26 ≥26 Kanamycin ≤ 17 17-25 ≥25 Trimethoprim ≤ 23 23-29 ≥ 29 Colistin ≤ 11 11-17 ≥ 17 Tetracyclin ≤ 18 18-25 ≥25 Rofampin ≤ 8 8-10 ≥ 10
Nguyên tắc phương pháp: Dùng pipet hút 200µl canh khuẩn đã chuẩn độ ở 106 CFU/ml nhỏ lên bề mặt đĩa thạch thường sau đó dùng que trang trải đều khắp mặt thạch, để khô, dùng kẹp vô trùng đặt các mẫu kháng sinh lên, một đĩa đặt 5 mẫu, 1 mẫu trung tâm, 4 mẫu đối xứng. Đem để tủ ấm 370C, thời gian 24h. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.
2.3.6. Thử nghiệm phác đồ điều trị cho lợn bị tiêu chảy
Từ kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được, chúng tôi tiến hành lựa chọn kháng sinh để điều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, phác đồ điều trị được thực hiện lặp lại 70-90 lần, lô đối chứng là loại kháng sinh mà trang trại, hộ đang sử dụng để triều trị.
Đánh giá hiệu quả của các điều trị căn cứ vào sự ổn định dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống … sau 2-5 ngày, kể từ khi dùng thuốc; hiệu quả kinh tế. Để lựa chọn loại kháng sinh phù hợp sử dụng phòng trị bệnh.
2.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.4.1. Mẫu thí nghiệm 2.4.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu phân lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy.
2.4.2. Dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm
- Buồng cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp.
- Kính hiển vi, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, bình tam giác, cốc đong, cân tiểu ly, phiến kính, dao kéo, panh, xiranh và các dụng cụ khác.
- Máy PCR, máy ly tâm, chụp gel,…
2.4.3. Môi trường, dung dịch, hóa chất
Môi trường nuôi cấy phân lập(Nguyễn Như Thanh và cs, 2006).
2.4.3.1. Môi trường nước thịt (Nutrient broth)
Thành phần:
- Peptone : 10 g
- NaCl : 5 g
- Cao thịt : 4 g
Cách pha chế: cho hỗn hợp (thành phần như trên) vào 1000ml nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy tan đều hỗn hợp hóa chất, dùng sơ ranh hút 5ml dung dịch vào ống nghiệm. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp 121o
C trong 15 phút.
2.4.3.2. Môi trường EMB
Môi trường EMB lỏng: Thành phần: - Lactose : 5 g - Saccarose : 5 g - Peptone : 10 g - K2HPO4 : 2 g - Eosin 8% : 5ml - Xanh methylen 1,3% : 5ml - Nước vừa đủ : 1 lít
Cách pha chế: tương tự như pha môi trường nước thịt.
2.4.3.3. Môi trường EMB Agar
Thành phần tương tự EMB lỏng + 1-2 % agar
Cách pha chế: hòa tan hỗn hợp vào 1000ml nước cất bằng đũa thủy tinh (có thể đun nóng để hóa chất dễ tan). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp 121o
C trong 15 phút. Sau khi hấp, lấy ra để vào tủ hạ nhiệt độ, đến lúc môi trường đạt khoảng 60-70o
C đem đổ môi trường vào đĩa lồng, mỗi đĩa đổ 20ml (thực hiện trong tủ cấy tiệt trùng). Sau đó gói các đĩa môi trường vào túi ni lông sạch cho vào tủ ấm.
2.4.3.4. Môi trường KIA (Kligler- Ion- Agar) - Thành phần: Agar 17 g Peptone 20 g Nacl 5 g Glucose 1 g Lactose 10 g Sodium thiosulphate 0,2 g Ferrous Ammonium sulphate 0,3 g
Phenol Red 0,2 % 12,5ml
Nước cất vừa đủ 1000ml
- Cánh pha: hòa tan hỗn hợp trên, lắc cho tan (pH môi truờng: 7), hấp 121 oC trong 15 phút rồi đổ ra ống nghiệm vô trùng, để nghiêng mặt thạch sao cho phần thạch đứng có độ dài 2 cm, phần thạch nghiêng dài 2-3 cm.
2.4.3.5. Môi trường Mannitol- Motility
- Thành phần: Peptone: 10 g Mannitol: 2 g Agar 2,5 g KNO3 1,7 g Phenol Red 0,2 % 20ml
- Cánh pha chế: trộn hỗn hợp trên với 1000 ml nước cất vô trùng hấp ở 121 o
C trong 15 phút (pH=7,5).
3.4.3.6. Môi trường Urea- Indol
- Thành phần: Peptone 1 g KH2PO4 2 g NaCl 5 g Urea 20 g Phenol Red 0,012 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml
Cách pha: Môi trường cơ bản không chứa urea được hòa tan trong 4/5 tổng dung tích cần thiết và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Dung dịch urea 10 % được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng và 1/5 của dung tích được bổ sung vào môi trường cơ bản đã hấp khử trùng và làm nguội. Môi trường đầy đủ