2) Ý nghĩa thực tiễn
2.3.4. Phương pháp xác định gene sản sinh kháng nguyên bám dính F18
2.3.4.1. Chuẩn bị mạch khuôn từ mẫu vật
Thực hiện theo mô tả của Nguyễn Xuân Hòa và cs (2010): Vi khuẩn E. coli
cấy vào môi trường LB lỏng sau 12 giờ thu sinh khối tiến hành tách DNA.
Bước 1: Hút 500 µl dung dịch mẫu (canh khuẩn) cho vào ống Eppendorf tương ứng. Ly tâm ở 40C trong thời gian 3 phút với tốc độ 3000 vòng phút. Hút bỏ dịch nổi (giữ lại cặn chứa vi khuẩn).
Bước 2: Tiếp tục ly tâm gạn rửa 2 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85 %.
Bước 3: Tái huyền phù bằng nước cất 2 lần 200µl, cho vào ống Eppendorf đun cách thủy 950
C/3-5 phút. Bước 4: Ly tâm 40
C, tốc độ 4000 vòng/ phút. Hút 100µl nước mặt có chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR bảo quản ở 4 0
C.
2.3.4.2. Chuẩn bị mồi (primer)
Mồi là những đoạn oligonucleotid có độ dài từ 18 - 30 nucleotid với trình tự sắp xếp các nucleotid đã xác định. Các cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) được dùng để xác định một số yếu tố độc lực của E. coli có trình tự nucleotid do Công ty BioRadcung cấp. Thực hiện theo mô tả của Nguyễn Xuân Hòa và cs (2013).
Bảng 2.1. Các cặp mồi và trình tự các cặp mồi
Mồi Trình tự mồi Gen Kích cỡ
(bp)
F18-F 66-GCAAGGGGATGTTAAATTC-84
F18 447
F18-R 512-TTGTAAGTAACCGCGTAAG-494
2.3.4.3. Thành phần các phản ứng PCR
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn với các cặp mồi F18
TT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR Master Mix 5 2 Primer xuôi 0,25 3 Primer ngược 0,25 4 Nước cất 3,5 5 DNA khuôn 1 Tổng 10
2.3.4.4. Chương trình chạy PCR
Bảng 2.3. Chương trình chạy PCR đơn với các cặp mồi F18
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian (phút)
Giai đoạn 1 1 94 5 Giai đoạn 2 30 94 1 55 1 72 1 Giai đoạn 3 1 72 10