2) Ý nghĩa thực tiễn
2.3.2. Phân lập vi khuẩn
2.3.2.1. Phương pháp xác định tính chất nuôi cấy
Các mẫu vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trên môi trường EMB (có agar và không agar), nước thịt, quan sát tính chất mọc của vi khuẩn trên các loại môi trường.
2.3.2.2. Phương pháp xác định hình thái vi khuẩn
Các mẫu vi khuẩn sau khi phân lập được nhuộm Gram và xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn E. coli là những trực khuẩn nhỏ bắt màu Gram âm, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn.
Phương pháp nhuộm Gram:
Cách pha thuốc nhuộm theo phương pháp của Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2006): - Dung dịch tím violet: Crystal violet 2 g Cồn 90º 20 ml Amonium oxalat 0,8 g Nước cất 80 ml
Cách pha chế: nghiền Crystal trong cồn 90º và nghiền amonium oxalat trong nước cất, trộn hai hỗn hợp lại với nhau lọc qua giấy lọc ta được thuốc nhuộm violet.
- Dung dịch fucshin:
Fucsin base 1 g Etanol 96º 10 ml
Phenol 5 g Nước cất 1000 ml
Cách pha chế: nghiền fucsin với 5 ml etanol quấy đều, đổ 2/3 lượng nước cất vào, quấy đều xong cho phenol vào, đem lọc qua giấy lọc và tráng cốc bằng 1/3 nước cất và 1/2 etanol còn lại.
- Dung dịch lugol:
Iot 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml
Cách pha chế: nghiền nhỏ KI và Iot với nhau, cho tiếp một lượng nước cất vào nghiền tiếp rùi lọc qua giấy lọc, cứ làm vậy cho hết 300 ml nước cất. Pha xong phải bảo quản trong chai tối màu.
- Dung dịch tẩy màu: cồn 96o
Cách nhuộm Gram:
Bước 1: Nhỏ dung dịch tím kết tinh lên tiêu bản để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, tiếp rửa nước nhanh, vẩy nước đi. Bước 3: Tẩy màu bằng cồn nguyên chất hoặc cồn axeton từ đầu phiến kính, nghiêng phiến khính cho cồn chảy qua chỗ phết vi khuẩn, tiếp rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Bước 4: Nhuộm bổ sung dung dịch fucsin loãng để 1 phút, rửa nước, vẩy khô nước. Thấm khô phiến kính, xem dưới vật kính dầu × 100. Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.