2) Ý nghĩa thực tiễn
2.4. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.4.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu phân lợn con sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy.
2.4.2. Dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm
- Buồng cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp.
- Kính hiển vi, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, bình tam giác, cốc đong, cân tiểu ly, phiến kính, dao kéo, panh, xiranh và các dụng cụ khác.
- Máy PCR, máy ly tâm, chụp gel,…
2.4.3. Môi trường, dung dịch, hóa chất
Môi trường nuôi cấy phân lập(Nguyễn Như Thanh và cs, 2006).
2.4.3.1. Môi trường nước thịt (Nutrient broth)
Thành phần:
- Peptone : 10 g
- NaCl : 5 g
- Cao thịt : 4 g
Cách pha chế: cho hỗn hợp (thành phần như trên) vào 1000ml nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy tan đều hỗn hợp hóa chất, dùng sơ ranh hút 5ml dung dịch vào ống nghiệm. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp 121o
C trong 15 phút.
2.4.3.2. Môi trường EMB
Môi trường EMB lỏng: Thành phần: - Lactose : 5 g - Saccarose : 5 g - Peptone : 10 g - K2HPO4 : 2 g - Eosin 8% : 5ml - Xanh methylen 1,3% : 5ml - Nước vừa đủ : 1 lít
Cách pha chế: tương tự như pha môi trường nước thịt.
2.4.3.3. Môi trường EMB Agar
Thành phần tương tự EMB lỏng + 1-2 % agar
Cách pha chế: hòa tan hỗn hợp vào 1000ml nước cất bằng đũa thủy tinh (có thể đun nóng để hóa chất dễ tan). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp 121o
C trong 15 phút. Sau khi hấp, lấy ra để vào tủ hạ nhiệt độ, đến lúc môi trường đạt khoảng 60-70o
C đem đổ môi trường vào đĩa lồng, mỗi đĩa đổ 20ml (thực hiện trong tủ cấy tiệt trùng). Sau đó gói các đĩa môi trường vào túi ni lông sạch cho vào tủ ấm.
2.4.3.4. Môi trường KIA (Kligler- Ion- Agar) - Thành phần: Agar 17 g Peptone 20 g Nacl 5 g Glucose 1 g Lactose 10 g Sodium thiosulphate 0,2 g Ferrous Ammonium sulphate 0,3 g
Phenol Red 0,2 % 12,5ml
Nước cất vừa đủ 1000ml
- Cánh pha: hòa tan hỗn hợp trên, lắc cho tan (pH môi truờng: 7), hấp 121 oC trong 15 phút rồi đổ ra ống nghiệm vô trùng, để nghiêng mặt thạch sao cho phần thạch đứng có độ dài 2 cm, phần thạch nghiêng dài 2-3 cm.
2.4.3.5. Môi trường Mannitol- Motility
- Thành phần: Peptone: 10 g Mannitol: 2 g Agar 2,5 g KNO3 1,7 g Phenol Red 0,2 % 20ml
- Cánh pha chế: trộn hỗn hợp trên với 1000 ml nước cất vô trùng hấp ở 121 o
C trong 15 phút (pH=7,5).
3.4.3.6. Môi trường Urea- Indol
- Thành phần: Peptone 1 g KH2PO4 2 g NaCl 5 g Urea 20 g Phenol Red 0,012 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml
Cách pha: Môi trường cơ bản không chứa urea được hòa tan trong 4/5 tổng dung tích cần thiết và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Dung dịch urea 10 % được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng và 1/5 của dung tích được bổ sung vào môi trường cơ bản đã hấp khử trùng và làm nguội. Môi trường đầy đủ được phân thành 3 ml vào các ống nghiệm vô trùng.
2.4.3.7. Hóa chất, thuốc thử
- Nước sinh lý, nước cất, dung dịch glycerol 40%, máu cừu. - Thuốc thử MR.
- Thuốc nhuộm Gram (tím Gentian, lugol, cồn, fucsin). - Giấy tẩm kháng sinh do công ty Nam Khoa cung cấp. - Các loại sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR:
Để xác định gene sản sinh kháng nguyên bám F18 của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR chúng tôi đã sử dụng các sinh phẩm cần thiết của BioRad như PCR buffer, dNTPs, Taq-polymerase, MgCl2 và cặp mồi đặc hiệu F18.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học và sử dụng phần mềm EpiCal2000 để kiểm định tỷ lệ:
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỶ LỆ MẪU DƯƠNG TÍNH VỚI VI KHUẨN E. COLI
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở 8 xã thuộc các vùng núi (Phúc Trạch), trung du (Hòa Trạch, Nam Trạch), đồng bằng (Hoàn Trạch, Mỹ Trạch) và ven biển (Đại Trạch, Nhân Trạch, Trung Trạch), tổng số lượng là 123 mẫu (danh sách lấy mẫu có ở Phụ lục 1). Tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli theo hướng dẫn của Phòng thí nghiệm Vi trùng - Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông - Lâm Huế. Kết quả xét nghiệm ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli.
TT Địa điểm lấy mẫu (xã) Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 1 Đại Trạch 18 12 66,67 2 Trung Trạch 15 13 86,66 3 Phúc Trạch 15 12 80,00 4 Hòa Trạch 15 10 66,67 5 Hoàn Trạch 15 15 100 6 Nhân Trạch 15 10 66,67 7 Mỹ Trạch 15 15 100 8 Nam Trạch 15 15 100 Cộng 123 105 85,37
Qua bảng 3.1 cho thấy cả 8 xã đều có tỷ lệ mẫu dương tính cao, tỷ lệ trung bình 85,37%. Trong đó, đáng chú ý là các xã thuộc vùng đồng bằng, trung du như Hoàn Trạch, Mỹ Trạch, Nam Trạch có tỷ lệ 100% mẫu dương tính, các xã vùng ven biển như Nhân Trạch, Đại Trạch, Trung Trạch có tỷ lệ thấp hơn.
Kết quả này thể hiện những vùng chăn nuôi tập trung, quy mô chăn nuôi theo hướng công nghiệp thì tỷ lệ dương tính với vi khuẩn E. coli thấp hơn so với quy mô chăn nuôi nhỏ lẻ, nông hộ. Các trang trại chăn nuôi theo hướng công
nghiệp đều có hệ thống chuồng lạnh nên có tiểu môi trường chuồng nuôi cơ bản ổn định. Công tác tiêm vacxin phòng bệnh, xử lý vệ sinh tiêu độc chuồng trại có quy trình. Công tác chăm sóc, nuôi dưỡng lợn con sau cai sữa được tốt hơn. Ngoài ra, hầu hết các trang trại đều sử dụng thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh nên trong thức ăn, nhất là cám cho lợn tập ăn (cám đỏ), một số nhà sản xuất có phối trộn kháng sinh để phòng bệnh. Vì vậy, một số lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy mà xét nghiệm âm tính với E. coli thì có thể do loại vi khuẩn khác gây ra hoặc là do một số trang trại đã sử dụng thức ăn có trộn kháng sinh, hoặc cũng có thể do thay đổi từ chuồng nái đẻ sang chuồng cai sữa nên lợn bị tiêu chảy sinh lý.
Kết quả về phân lập được vi khuẩn E. coli trong nghiên cứu này tương đương với các nghiên cứu của một số tác giả đã công bố. Cù Hữu Phú và cộng sự (2000), khi tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân của lợn từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi bị tiêu chảy, đã xác định được 60/70 mẫu có vi khuẩn E. coli
chiếm tỷ lệ 85,71%. Trịnh Quang Tuyên và cộng sự (2004) khi tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân của lợn bị tiêu chảy, đã xác định được 259/325 mẫu có vi khuẩn E. coli, chiếm tỷ lệ 79,69%. Lý Thị Liên Khai (2001) cũng phân lập được 42 mẫu phân có vi khuẩn E. coli, chiếm tỷ lệ 84% trong tổng số 50 mẫu phân lợn con bị tiêu chảy.
Hình 3.2. Phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy.
3.2. KẾT QUẢ KIỂM TRA HÌNH THÁI, ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY
Mẫu phân sau khi chuyển đến phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tiền tăng sinh trong môi trường EMB lỏng, EMB aga, nước thịt, nhuộm gram. Kết quả hình thái vi khuẩn E. coli phân lập được thể hiện như sau:
- Vi khuẩn E. coli được nuôi cấy khởi đầu trên môi trường tăng sinh EMB lỏng có đặc điểm là làm màu của môi trường chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lục.
- Trên môi trường phân lập EMB agar, vi khuẩn E. coli tạo khuẩn lạc màu tím đen, có ánh kim.
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc E. coli trên môi trường EMB agar
- Trên môi trường nước thịt nuôi cấy tăng sinh, vi khuẩn làm đục môi trường, có cặn màu tro trắng lắng xuống, đôi khi có váng xám nhạt trên mặt môi trường.
- Nhuộm Gram: Tất cả các vi khuẩn phân lập được đều bắt màu hồng là Gram âm sau khi nhuộm Gram.
Hình 3.6. Hình thái vi khuẩn E. coli sau khi nhuộm Gram
So sánh các kết quả hình thái, đặc tính nuôi cấy của các chủng E. coli phân lập được trong nghiên cứu này đều có đặc điểm chung, rất điển hình của vi khuẩn
E. coli như các tài liệu mà các tác giả trong và ngoài nước đã công bố.
3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐẶC TÍNH SINH VẬT VÀ HÓA HỌC
Chúng tôi chọn đại diện 24 chủng vi khuẩn phân lập được của 8 xã, tiến hành xác định một số tính chất sinh hóa trên các môi trường theo thứ tự sau: Citrat, KIA, MUI, Methyl red, Glucose, Saccarose, Lactose. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ, kết quả được thể hiện như sau:
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả sinh hóa TT Chỉ tiêu Số mẫu kiểm tra Phản ứng Dương tính Tỉ lệ (%) 1 Glucose 24 24 100 2 Lactose 24 24 100 3 Saccarrose 24 24 100 4 Sinh hơi 24 24 100 5 Sinh H2S 24 0 0 6 Di động 24 24 100 7 Sinh indol 24 24 100 8 Sinh ure 24 0 0 9 Methyl Red (MR) 24 24 100 10 Citrate 24 0 0
Bảng 3.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli phân lập được
C hỉ ti êu C it ra te Glu co se L a ct o se Sa cc h a rr o s Sinh h ơ i H2 S D i đ ộn g U re Ind o l MR Kết quả - + + + + - + - + + Chú thích: + dương tính, - âm tính
Hình 3.7b. Kết quả xác định tính chất sinh hóa
Từ các kết quả trên ta có thể thấy:
Ở ống nghiệm citrate không thấy đổi màu môi trường, chứng tỏ vi khuẩn không có khả năng sử dụng nguồn citrate, phản ứng âm tính.
Ở ống nghiệm môi trường KIA, ngoài khả năng lên đường làm đổi màu chất chỉ thị, còn thấy phần đáy ống kiệm có sinh hơi, đẩy phần thạch lên khỏi mặt đáy và không thấy màu đen ở đáy ống nghiệm chứng tỏ vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh hơi nhưng không sinh H2S.
Ở ống nghiệm môi trường MUI quan sát thấy vi khuẩn mọc đục xung quanh đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di động. Sau khi nhỏ 4 – 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm thấy xuất hiện một vòng màu đỏ trên mặt thạch. Có thể giải thích rằng vi khuẩn có khả năng hình thành men tryptophanaza phân giải tryptophan có trong môi trường làm sinh indol. Sau khi nhỏ thuốc thử vào, indol sẽ kết hợp với paradimetyl amino benzaldehyl có trong thuốc thử để tạo thành một hợp chất có màu đỏ gọi là rosindol, do đó trên bề mặt tiếp xúc có một vòng màu đỏ sẫm.
Ở phản ứng MR, sau khi nuôi cấy trong tủ ấm 2 – 3 ngày, nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử đỏ metyl vào, để một lúc thấy môi trường chuyển thành đỏ, chứng tỏ vi khuẩn có phản ứng MR dương tính. Môi trường dùng là môi trường pepton glucose. Phản ứng này dùng để phân biệt E. coli với Enterobacter aerogenes(*).
Enterobacter aerogenes lên men glucose tạo thành acid piruvic và tiếp tục chuyển hóa thành axetyl metyl cacbinol trung tính, pH môi trường sẽ đạt tới 5,4. Khi nhỏ đỏ metyl vào môi trường có màu vàng là phản ứng âm tính. Còn E. coli cũng lên men đường glucose tạo thành acid piruvic và tiếp tục chuyển hóa acid thành etanol,
cid acetic, H2, CO2, acid lactic và acid succinic làm cho pH môi trường hạ thấp đến 4,5 hoặc thấp hơn nữa. Khi nhỏ đỏ metyl vào, môi trường có màu đỏ, như vậy phẩn ứng MR dương tính.
Trong các phản ứng lên men các loại đường Glucose, Saccharose, Lactose, môi trường đều chuyển từ màu đỏ sang màu vàng. Do trong các môi trường đó có chất chỉ thị màu đỏ phenol, chất này có màu đỏ ở pH kiềm và chuyển thành màu vàng ở pH axit. Vi khuẩn phân lập được có khả năng sử dụng các loại đường đó, lên men sinh axit nên làm pH của môi trường giảm thấp và làm thay đổi màu chất chỉ thị.
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chúng tôi thì thấy các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập được từ lợn con sau cai sữa tại huyện Bố trạch, tỉnh Quảng Bình đều giống với các tính trạng giám biệt của vi khuẩn E. coli đã được Phạm Hồng Sơn (2013) mô tả và đúng với TCVN 4800 – 16: 2011.
3.4. KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG DUNG HUYẾT
Để đánh giá khả năng dung huyết của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy kiểm tra 92 mẫu. Kết quả thu đươc là vi khuẩn phát triển rất tốt trên môi trường thạch máu và cho tỷ lệ như sau:
Bảng 3.4. Tỷ lệ dung huyết của vi khuẩn E. coli
STT Địa điểm lấy mẫu
Số lượng mẫu
xét nghiệm Số lượng mẫu dung huyết Tỉ lệ (%)
1 Đại Trạch 8 2 25 2 Trung Trạch 8 0 0 3 Phúc Trạch 10 3 30 4 Hòa Trạch 12 2 16,7 5 Hoàn Trạch 15 2 13,3 6 Nhân Trạch 12 2 16,7 7 Mỹ Trạch 12 1 8,5 8 Nam Trạch 15 2 13,3 Tổng 92 14 15,2
Hình 3.8. Khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli phân lập được
Qua bảng 3.4 cho thấy có 14/92 mẫu gây dung huyết, chiếm tỷ lệ 15,2%. Trong đó, xã có tỷ lệ mẫu dung huyết cao nhất là Phúc Trạch (30%), xã có số mẫu không phát hiện khả năng dung huyết là Trung Trạch. Kết quả này phản ánh các xã vùng núi chủng E. coli gây dung huyết có tỷ lệ lớn hơn các xã vùng ven biển.
Kết quả nghiên cứu tỷ lệ dung huyết của chúng tôi cũng tương đương với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trường Giang (2014), khi xác định tỉ lệ mẫu gây dung huyết của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở lợn con theo mẹ tại huyện Kỳ Anh – Hà Tĩnh là 15%.
Từ hình 3.8 ta thấy một vòng sáng xung quanh khuẩn lạc trong suốt và rộng do hồng cầu bị phá vỡ hoàn toàn. Vì vậy, E. coli gây dung huyết ở huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình là kiểu β.
3.5. TỶ LỆ MANG GENE KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH F18
Trong 105 mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli, chúng tôi chọn 42 mẫu của 8 xã theo hình thức ngẫu nhiên, tiến hành thử gene kháng nguyên bám dính F18, kết quả phân tích có ở bảng 3.2.
Qua bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 là 19,05%, trong đó cao nhất là Nam Trạch, Hoàn Trạch (40%), Trung Trạch và Hòa Trạch không có, Phúc trạch và Mỹ Trạch (20%), Nhân Trạch và Đại Trạch (16,67)%. Kết quả này chứng minh lợn sau cai sữa nuôi ở các trang trại, quy mô công nghiệp có tỷ lệ mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18 thấp hơn nuôi ở các nông hộ.
Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu bệnh phẩm phân lợn con bị bệnh tiêu chảy mang gene quy định kháng nguyên bám dính F18
TT Địa điểm lấy mẫu Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) 1 Đại Trạch 6 1 16,67 2 Trung Trạch 5 0 0 3 Phúc Trạch 5 1 20,00 4 Hòa Trạch 5 0 0 5 Hoàn Trạch 5 2 40,00 6 Nhân Trạch 6 1 16,67 7 Mỹ Trạch 5 1 20,00 8 Nam Trạch 5 2 40,00 Cộng chung 42 8 19,05
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đương với kết quả của các tác giả: Nguyễn Xuân Hòa và cs (2013) đã xác định tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 từ các mẫu phân lợn bị tiêu chảy trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế là 22,11%. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Hữu Mến (2014), khi xác định tỷ lệ mang gene kháng nguyên bám dính F18 từ các mẫu phân bị tiêu chảy nuôi tại huyện Hương Sơn, tỉnh Hà Tỉnh cũng cho kết quả 21,27%. Như vậy, E. coli gây bệnh trên địa bàn huyện Bố Trạch, tỉnh Quảng Bình có gene kháng nguyên bám