Thí nghiệm1: Nghiên cứu sự thay đổi một số tính chất của hỗn hợp bã đậu nành

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

2.2.1. Thí nghiệm1: Nghiên cứu sự thay đổi một số tính chất của hỗn hợp bã đậu nành

theo tỷ lệ khác nhau. Từ đó, xác định được tỷ lệ phối trộn thích hợp và thời gian ủ thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho lợn

2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DC5 có khả năng phát triển, sinh tổng hợp

enzyme ngoại bào và thủy phân các hợp chất cao phân tử trong bã đậu nành - Chủng Lactobacillus plantarum N5 có khả năng lên men bã đậu nành

- Bã đậu nành (okara), phế phụ phẩm của cơ sở cô Chi sản xuất sữa đậu nành ở Phường Tây Lộc, Thành phố Huế, với hàm lượng protein và chất xơ như sau:

+ Hàm lượng protein tổng số tính theo bã ướt: 4,8% + Hàm lượng protein tổng số tính theo chất khô: 29,7%

+ Hàm lượng xơ không tan trong môi trường trung tính tính theo bã ướt: 3,37%. + Hàm lượng xơ không tan trong môi trường trung tính tính theo chất khô: 20,82%

2.2.1.2. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

Nghiệm thức 1: Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bã đậu nành theo tỷ lệ 1:01 (1 B. subtilis DC5 + 1 L. plantarum N5).

Nghiệm thức 2: Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bã đậu nành theo tỷ lệ 1:02 (1 B. subtilis DC5 + 2 L. plantarum N5).

Nghiệm thức 3: Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bã đậu nành theo tỷ lệ 2:01 (2 B. subtilis DC5 + 1 L. plantarum N5).

Nghiệm thức 4: Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bã đậu nành theo tỷ lệ 0:01 (1 L. plantarum N5).

2.2.1.3. Chuẩn bị mẫu và giống quy trình lên men

Bã đậu nành được nhập tại một cơ sở sản xuất trong suốt quá trình thí nghiệm, sau đó lấy được cân vào mỗi túi ni lông đựng 200g rồi tiến hành hấp tiệt trùng trong vòng 60 phút ở nhiệt độ 1210C. Làm nguội mẫu thí nghiệm tiến hành phối trộn hỗn hợp chủng vi sinh vật theo tỷ lệ trên. Đánh kí hiệu các nghiệm thức ngoài bao ni lông. Sau đó lấy mẫu phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu tại các thời điểm 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ngày ủ.

Phương pháp chuẩn bị chủng vi khuẩn thương mại: dùng chủng bột thương mại bao gồm Bacillus subtilis DC5 và Lactobacillus plantarum N5.

Phương pháp ủ tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus plantarum N5: Chuẩn bị 50 ml dung dịch MRS broth (đã tiệt trùng) là môi trường tăng sinh của giống vi khuẩn probiotic. Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ 37oC. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

(N5) từ ống eppendorf (bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -80oC được rã đông và cho vào dung dịch MRS broth. Sau các khoảng thời gian ủ tăng sinh 1 ngày ở nhiệt độ 37oC, thực hiện đếm số khuẩn lạc và tính mật số vi khuẩn lactic để tiến hành cấy vào mẫu bã đậu nành theo các tỷ lệ của thí nghiệm.

Phương pháp ủ tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis DC5: Chuẩn bị 50 ml dung dịch môi trường cơ bản bao gồm: 10g pepton, 3g NaCl, 5g cao thịt và nước cất sau đó thì được tiệt trùng trong vòng 60 phút ở nhiệt độ 1210

C rồi làm nguội dung dịch đến nhiệt độ 37oC . Vi khuẩn Bacillus subtilis DC5 từ ống eppendorf bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -80oC được rã đông và cho vào dung dịch môi trường cơ bản. Tất cả các thao tác đều tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sau các khoảng thời gian ủ tăng sinh 1 ngày ở nhiệt độ 37o

C thực hiện đếm số khuẩn lạc và tính mật số vi khuẩn lactic để tiến hành cấy vào mẫu bã đậu nành theo các tỷ lệ của thí nghiệm.

2.2.1.4. Các chỉ tiêu nghiên cứu

- Biến đổi hoạt độ amylase (U/ml). - Biến đổi hoạt độ protease (HP/g). - Biến đổi pH theo thời gian bảo quản.

2.2.1.5. Phương pháp nghiên cứu

a. pH của quá trình lên men và quá trình bảo quản sản phẩm được xác định bằng máy đo pH điện tử.

b. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến (Mukherjee et al., 2008) - Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) được ủ ở 30oC, 10 phút; phản ứng được kết thúc bằng cách cho dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch axit cho 1 thể tích enzyme vào hỗn hợp phản ứng.

Dịch nổi thu được sau khi ly tâm được sử dụng để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Mẫu kiểm tra được thực hiện đồng thời bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất.

Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang phổ kế ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine, để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease (HP) được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút ở 30o

C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong axit tricloacetic, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine.

- Tính kết quả: từ kết quả OD đo được

+ Dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrozin tương ứng

+ Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 1ml dung dịch enzyme đã lấy xác định hoạt độ theo công thức:

HP/ml = t 8 . tyrozin µmol đơn vị Trong đó: t: thời gian phản ứng

8: số phần thể tích của các dung dịch phản ứng Hoạt độ tính theo gam HP/g =

b: số gam canh trường B. subtilis đem đi ly tâm

- Phương trình đường chuẩn tyrosine: y = 1,8207x + 0,0501 y: OD750nm, x: nồng độ tyrozin µmol/ml

c. Xác định hoạt độ amylase bằng phương pháp Bernfiel (Asgher et al., 2007) - Tinh bột được sử dụng làm cơ chất để xác định hoạt độ amylase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử 3,5-axit dinitrosalisilic (hòa tan 1g axit 3,5-dinitrosalisilic (DNS) trong 20 ml NaOH 2N và 50ml nước cất, cho thêm 30g kali/natri tartrate và dẫn nước đến 100 ml).

- Độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm. Dựa vào đường chuẩn để tính sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme.

+Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml 1% tinh bột (hòa tan 1g tinh bột và 35mg NaCl trong 60ml dịch đệm phosphate, pH = 7, đun sôi cho đến tan, để nguội và dẫn đến 100ml) và 0,1ml dung dịch enzyme. Tiếp tục hỗn hợp phản ứng được ủ 10 phút ở 30C. Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2 ml dung dịch 1% DNS và ủ 10 phút ở 100C, sau đó, ủ 10 phút trong nước đá rồi bổ sung 2 ml nước cất vào hỗn hợp và so màu ở 540nm.

- Mẫu trắng được làm song song với mẫu chuẩn nhưng enzyme bị biến tính 10 phút trong nước sôi và 1% DNS.

- Lượng đường khử tạo thành được xác định dựa vào đường chuẩn maltose. Một đơn vị hoạt độ α-amylase được xác định là lượng μmol maltose tạo thành bởi 1 ml dịch enzyme trong thời gian 1 phút ở 30C.

- Tính kết quả:

Từ giá trị OD thu được, dựa vào phương trình đường chuẩn maltose để biết nồng độ maltose.

Một đơn vị hoạt độ α-amylase được xác định là lượng μ mol maltose tạo thành bởi 1ml dịch enzyme trong thời gian một phút ở nhiệt độ 30oC.

Hoạt độ (U/ml) =

Trong đó t: thời gian phản ứng v: thể tích enzyme Hoạt độ U/g =

a: số ml đệm cho vào để trích ly enzyme. b: số gam canh trường vi sinh vật đem đi ly tâm - Phương trình đường chuẩn maltose : y = 0,0507x + 0,014 Trong đó: y: OD540nm, x: nồng độ maltose µmol/ml