V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3
2.2.2. Trong phòng thí nghiệm 25
Phân lập ấu trùng metacercariae trên mẫu cá thịt
Áp dụng phương pháp tiêu cơ để phân lập ấu trùng sán lá truyền qua cá ở phụ lục 6 của WHO [1].
Các bước tiến hành phân lập metacercariae:
1. Định loại loài cá.
2. Cân từng cá thể và ghi lại.
3. Cá nhỏ (dưới 50g/con) được xay nguyên con bằng máy xay sinh tố. Cá lớn được chia thành các mẫu nhỏ có khối lượng khoảng 50 - 100g và chọn ngẫu nhiên cho vào máy xay nhuyễn. Mỗi con cá trong từng mẫu thu (1 ao) sẽ được xay riêng.
4. Cho mẫu xay của từng con cá vào cốc thuỷ tinh đã đánh dấu chứa dung dịch dạ dày nhân tạo (6g pepsin +8 ml HCl + 1 lít nước cất), chuyển vào tủ ấm 37oC ủ trong khoảng 3 giờ.
5. Lấy mẫu ra khỏi tủ ấm, lọc mẫu bằng lưới lọc có mắt lưới 1x1mm và rửa sạch bằng nước muối sinh lý (0,86%).
6. Loại bỏ phần nổi một cách nhẹ nhàng, lấy phần lắng, làm như vậy khoảng 8 - 10 lần cho đến khi chất lắng trở nên trong.
7. Cho phần lắng vào đĩa Petri soi dưới kính soi nổi để xác nhận sự hiện diện của metacercariae.
8. Khi phát hiện có metacercariae, dùng ống hút các nang sán trong cùng mẫu cá qua đĩa petri nhỏ có chứa nước muối sinh lí để định loại.
Định loại ấu trùng truyền qua cá
Mỗi mẫu cá có thể nhiễm một hay nhiều loại metacercariae khác nhau. Ấu trùng metacercariae trong từng mẫu sẽ được phân loại thô qua kích thước (lớn hay nhỏ), hình dạng nang (hình tròn hoặc hình bầu dục), quan sát dưới kính soi nổi Nikon SMZ 745.
Sau đó, nang sán sẽ được định loại chi tiết hơn ở độ phóng lớn ở kính hiển vi đảo ngược Nikon Eclipse Ti, quan sát các đặc điểm hình thái quan trọng của ấu trùng (giác miệng, giác bụng, túi bài tiết, răng trên giác bụng hoặc giác miệng,…)và phân loại dựa theo khóa phân loại metacercariae. Sử dụng khóa định loại ấu trùng (phụ lục 2, 3) kết hợp với tài liệu mô tả hình thái xác định loài sán [18].
Công thức tính tỉ lệ nhiễm sán trên cá
Tỉ lệ nhiễm (%) = ố ẫ á ễ
ố ẫ á ể x 100
Phương pháp phân tích số liệu
Sử dụng Microsoft Excel 2010 và SPSS (Statistical Package for Social Sciences version 20; SPSS Inc., Chicago, Illinois) để nhập số liệu và phân tích.
Phương pháp phân tích hồi quy Binary logistic regression được dùng để phân tích, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố rủi ro đến sự nhiễm metacercariae trong mô hình nuôi với P < 0,05.
Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU