2. Kiến thức chuyên môn:
1.4.3 Một số ứng dụng trong dược – mỹ phẩ m:
Các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết lá xoài đã được áp dung vào nhiều sản phẩm như thuốc bôi da và thuốc uống. Tuy nhiên, vì cao chiết lá xoài còn có khả năng kháng viêm, chống oxy hoá nên nếu nghiên cứu rộng hơn có thể áp dụng vào kem, sữa rửa mặt trị mụn, selrum hoặc các sản phẩm giúp chăm sóc da mặt, se khít lỗ chân lông. Bên cạnh đó còn có thể phát triển các hợp chất trong cao chiết theo hướng như một loại thực phẩm chức năng giúp tăng cường hệ miễn dịch, bồi bổ sức khoẻ.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Bên cạnh đó, nếu kết quả định tính trong sản phẩm thô có sự xuất hiện của hỗn hợp chất sinh học mangiferin thì ta có thể tiến hành tinh chế mangiferin từ cao lá xoài theo phương pháp sau :
• Tinh chế mangiferin
Nếu kết quả định tính trong sản phẩm thô có sự xuất hiện của hỗn hợp chất sinh học mangiferin thì ta tiến hành tinh sạch mangiferin. Hòa tan mangiferin thô với ethanol 80% theo tỉ lệ dung môi : nguyên liệu lá 100 : 1(l/kg), chuyễn hỗn hợp vào Becher đun trên bếp khuấy từ, đun sôi lăn tăn đến nhiệt độ 70 - 80oC và giữ trong 2h. Sau đó, làm nguội hỗn hợp xuống 55oC và bổ sung than hoạt tính.
Mangiferin thô
Mangiferin Tinh khiết Dịch chiết B Dịch chiết A
1. Hoà tan với Ethanol 80% 2. Đun sôi, t = 70 – 80 OC, 2h 3. Làm nguội, t = 55 OC 4. Bổ sung than hoạt tính
5. Lọc than
6. Cô dịch
7. Kết tinh, t = 4 – 8 OC, qua đêm 8. Lọc, rửa
9. Sấy t = 60 OC
Hình 1.10: Sơ đồ quy trình tinh chế Mangiferin từ cao chiết lá xoài
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Bổ sung than hoạt tính : Khi sản xuất thuốc bằng phương pháp chiết xuất từ dược liệu, ở giai đoạn tinh chế, để làm sạch dung dịch khỏi các chất bẩn, chất màu người ta thường dùng than hoạt tính để tẩy màu, loại bỏ một số tạp chất lẫn trong sản phẩm thô. Than hoạt được bổ sung theo tỉ lệ 5%, có nghĩa cứ 10g sản phẩm thô sẽ bổ sung 0,5g than hoạt tính. Tiếp tục đun sôi 30 - 60 phút để than hoạt hấp thụ các chất màu, chất bẩn. Ta được dịch chiết A.
Lọc than : Sau khi đun đến thời gian, thu dịch chiết C và lọc nóng bằng thiết
bị lọc chân không. Để quá trình lọc đạt hiệu quả tốt, cần bổ sung thêm bột trợ lọc và giấy lọc. Thu dịch lọc, ta được dịch chiết B.
Cô đặc : Dịch chiết B được đem đi cô đặc trong thiết bị cô chân không đến 1/5
thể tích dịch chiết. Thu dịch, kết tinh lạnh 4 - 8oC qua đêm để mangiferin lắng xuống. Dùng nước RO và Cloroform để rửa tủa bằng thiết bị lọc chân không, để đảm bảo hiệu quả tinh sạch mangiferin tinh khiết nên rửa nước 3 lần và rửa lại bằng Ethanol 1 lần để loại hết những hợp chất không cần thiết.
Sấy : sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 60oC trong tủ sấy. Sản phẩm cuối cùng thu được có dạng bột màu vàng ánh kim nhạt có thể là mangiferin tinh khiết.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng, thiết bị, dụng cụ, hoá chất nghiên cứu:
Đối tượng: mẫu lá xoài tại huyện Long Điền, thành phố Bà Rịa, tỉnh BRVT.
Dụng cụ, thiết bị:
Bảng 2. 1 Dụng cụ cần thiết
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Becher 50ml 12 Bình lọc chân không
2 Becher 100ml 13 Soxhlet
3 Becher 250ml 14 Cô quay chân không
4 Becher 500ml 15 Bếp điện
5 Erlen 250ml 16 Cân điện
6 Ống nhỏ giọt 17 Nồi đun cách thuỷ
7 Ống đong 10ml 18 Máy sấy
8 Phễu lọc không đuôi 19 Tủ sấy
9 Phễu Bucher 20 Muỗng thuỷ tinh
10 Giấy lọc 21 Vi quản
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Bảng 2. 2 Hoá chất cần dùng
STT Hoá chất STT Hoá chất STT Hoá chất
1 Etanol 5 n-butanol 9 HCl đặc 2 Mg 6 Acid Acetic 10 FeCl3 3 Aceton 7 Cloroform 11 TLC 4 H2O 8 NaOH 12 H2SO4
2.2 Quy trình chiết tách tạo cao lá xoài:
Xử lý nguyên liệu: Lá xoài được thu hái ở Long Điền, BRVT. Thời gian hái
vào buổi trưa, từ tháng 1/2019 đến tháng 4/2019. Chọn lá là lá già có màu xanh thật đậm. Lá được rửa thật sạch để loại bỏ tạp chất (sương, bụi bậm, thuốc trừ sâu, …), sấy khô trong tủ sấy ở 600C đến khi khối lượng không đổi, xay hơi nhuyễn thành những chút nhỏ, gần thành bột.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Giải thích quy trình :
a) Chiết xuất tạo cao chiết lá xoài
Xử lí nguyên liệu : Lá xoài sau khi thu nhập được sấy khô ở nhiệt độ 60oC với mục đích bảo quản dược liệu khỏi bị nhiễm mốc, vi khuẩn, bị tác động bởi enzym và hạn chế các biến đổi hóa học có thể xảy ra trong dược liệu như bị thủy phân, oxy hóa, đồng phân hóa. Sau khi sấy khô, nghiền nhỏ nguyên liệu bằng máy xay sinh tố, xay nhỏ gần thành bột. Lá xoài Sấy khô Xay gần thành bột Bột lá xoài khô Bột cây còn lại Bột cây còn lại Dịch chiết Cao chiết Loại bỏ cành và các mảng lá to
Ngâm lạnh với Aceton để loại bỏ Tannin. Lọc lấy bột cây
Ngâm dầm với Ethanol 80%
Cô cạn
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Chiết hồi lưu : bột lá xoài sau khi xay cho vào túi, chiết hồi lưu 12 giờ bằng hệ
thống Soxhlet với dung môi là Ether dầu hoả nhằm loại bỏ chất béo và tinh dầu trong lá.
Ngâm lạnh : lấy bột lá ngâm lạnh với Aceton trong 30 giờ để loại bỏ Tanin (nhiệt
độ 8 – 10oC).
Ngâm dầm : lọc lấy bột còn lại, đem ngâm dầm trong Etanol 80% trong khoảng
12 giờ.
Loại bỏ dung môi : lọc lấy dịch chiét đem đi cô cạn bằng máy Cô quay chân không
(áp suất thấp) để loại bỏ dung môi thu được cao chiết màu xanh đen.
Hình 2. 5 chưng cất bằng hệ thống Soxhlet
Hình 2. 4 Ngâm dầm trong cồn 80%
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Có thể đem dịch chiết để qua đêm ở nhiệt độ 10 – 150C để tạo cắn nếu muốn lắng tạo Mangiferin dạng tinh thể từ cao chiết.
Lọc : quá trình phân riêng 2 pha rắn-lỏng ra khỏi nhau bằng cách cho hỗn hợp đi
qua thiết bị lọc chân không, thu được sản phẩm thô, thời gian được rút ngắn nhờ lực hút chân không. Sau đó, ta thu được cao chiết lá xoài như hình 2.8 dưới đây :
Hình 2. 8 Cao chiết lá xoài
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
2.3 Khảo sát điều kiện chiết tách tối ưu
2.3.1 Lựa chọn dung môi
Ta cân chính xác 5 cốc có khối lượng như nhau là 15g bột lá xoài khô và tiến hành trích ly cùng một điều kiện như nhau ở những bước đầu. Tuy nhiên, đến giai đoạn ngâm dầm, ta tiến hành ngâm dầm với 5 loại dung môi khác nhau với độ phân cực tăng dần: - n-hexan - Chloroform - Etyl Acetat - Ethanol - Methanol
Tiến hành ngâm dầm trong 12h. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi và tính toán kết quả.
2.3.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
Trong quá trình trích ly, nồng độ của dung môi càng lớn thì chất tan càng dễ khuếch tán vào trong dung môi [Nguyễn Bin, 2005]. Tuy nhiên đến một ngưỡng nhất định dung môi sẽ bị bão hoà, nên cần khảo sát để tránh lãng phí dung môi bằng cách : Cân chính xác một số túi bột lá xoài với khối lượng là 15g. Tiến hành trích ly trong cùng một điều kiện như nhau ở những bước ngâm dầm. Tuy nhiên, đến giai đoạn ngâm dầm, ta tiến hành ngâm dầm với những thể tích dung môi khác nhau theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi lần lượt là 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11 và 1/12 (g/ml). Ngâm dầm trong 12h. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi nhận và tính toán kết quả.
2.3.3 Khảo sát nồng độ của dung môi :
Một loại dung môi có thể được pha loãng ra nhiều nồng độ khác nhau. Việc pha loãng này nhằm mục đích điều chỉnh độ phân cực của dung môi cho sát với độ phân cực của hợp chất ta cần trích ly, từ đó tăng hiệu suất chiết tách. Bên cạnh đó pha loãng dung môi cũng giúp ta tiết kiệm được dung môi và chi phí.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Tiến hành chuẩn bị thí nghiệm như 2 khảo sát trước. Tuy nhiên đến giai đoạn ngâm dầm, ta ngâm dầm bột lá xoài bằng dung môi với các nồng độ thay đổi khoảng 10%, thực hiện từ 4 – 5 lần. Sau đó ngâm dầm trong 12 tiếng. Sau đó đem đi cô quay chân không để đuổi dung môi và tiến hành cân khối lượng cao chiết thu được. Ghi nhận và tính toán kết quả.
2.3.4 Khảo sát thời gian ngâm dầm :
Đối với kĩ thuật ngâm dầm, một lượng dung môi chỉ có thể hoà tan một lượng nhất định chất tan, nên thông thường kĩ thuật ngâm dầm chỉ được áp dung trong khoảng từ 10 – 24 tiếng. Chính vì thế ta cần phải khảo sát thời gian ngâm dầm nhằm mục đích đạt hiệu suất trích ly tối ưu, tránh gây mất thêm thời gian mà không thu được thêm cao chiết. Tiến hành thực nghiệm qua 3 lần, chuẩn bị thí nghiệm như trên : - Lần 1 : khảo sát thời gian ngâm dầm từ 6 – 15 tiếng. Ta chọn bước nhảy rộng là 3 tiếng nhằm mục đích xác định mốc thời gian thu được cao chiết cao nhất. - Lần 2 : lựa chọn mốc thời gian thu được cao chiết cao nhất từ lần 1 làm chuẩn. Sau đó tiến hành khảo sát với bước nhảy hẹp hơn là 2 tiếng xoay quanh mốc thời gian đó. Xem xét sự thay đổi của 2 tiếng trước và sau mốc thời gian này. Tiếp tục chọn ra mốc thời gian thu được khối lượng cao chiết lớn nhất.
- Lần 3 : tiến hành khảo sát mốc thời gian đã chọn ở lần thứ 2 với bước nhảy hẹp hơn là 1 tiếng. Xem xét sự thay đổi khối lượng cao chiết của 1 tiếng trước và sau mốc thời gian đó. Ghi nhận và tính toán kết quả trung bình nhằm tránh sai số.
2.4. Phương pháp định tính thành phần hoá học cao lá xoài bằng phương pháp màu đặc trưng:
➢ Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol, …). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn.
❖ Nhận biết Steroid – triterpenoid: dùng thuốc thử Liebermann – Burchard:
• Anhidrid acetic 1 ml
• H2SO4 đậm đặc
Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính.
➢ Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật. Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform, … Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine).
Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như ca cao, cà phê, …). Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc.
❖ Thuốc thử Alkaloid: dùng Thuốc thử Wagner:
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
- KI 2 g
- H2O vừa đủ 100 ml
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch alcol, nghiên ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
➢ Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa, ... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng.
Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ.
Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A.
❖ Thuốc thử Flavnoid:
o Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.
➢ Khảo sát sự hiện diện của saponin
❖ Định tính saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc thử: HCl 0,1N NaOH 0,1N
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
- Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử. - Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.