2. Kiến thức chuyên môn:
2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá :
Một phương pháp đo quang phổ đã được phát triển để xác định định lượng khả năng chống oxy hóa. Xét nghiệm dựa trên việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa. Có mối quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Mối quan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa với nhiều phân loại.
Phương pháp thực nghiệm: đánh giá tổng năng lực chống oxy hóa bằng cách
cho một lượng 0,1 ml dung dịch mẫu chứa một loại chất khử (trong ethanol) đã được kết hợp trong một ống Eppendorf với 1 ml dung dịch thuốc thử (axit sulfuric 0,6 M, natri phosphat 28 mM, và 4 m M amoni molybdate). Các ống được đậy nắp và ủ ở 95 °C trong 90 phút. Sau khi các mẫu được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, độ hấp thụ của dung dịch nước của từng mẫu được đo ở 695 nm so với mẫu trắng. Một dung dịch trắng điển hình chứa 1 ml dung dịch thuốc thử và thể tích thích hợp của cùng dung môi được sử dụng cho mẫu và được ủ trong cùng điều kiện với các mẫu còn lại.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hoá quá trình tạo cao chiết lá xoài
3.1.1 Kết quả khảo sát dung môi :
Bảng 3. 1: Khối lượng cao chiết thu được theo dung môi
Việc lựa chọn dung môi trong quá trình trích ly hết sức quan trọng, cần đảm bảo trích ly được các chất mong muốn với hiệu suất cao, chất lượng tinh dầu tốt, đáp ứng yêu cầu kinh tế. Năm loại dung môi khác nhau được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát bao gồm N – hexan, Cloroform, Etyl Acetat, Ethanol và Methanol. Kết quả thể hiện ở bảng dưới đây cho thấy, đối với các dung môi phân cực lớn như methanol, ethanol hiệu quả thu cao chiết cao, đặc biệt là Metanol hiệu suất lớn nhất đạt 50,68%. Trong khi đó, các dung môi không phân cực là N-hexan và cloroform, hiệu suất thu hồi giảm rõ rệt với giá trị tương ứng là 20,50% và 26,28%.
Hình 3. 1: Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo dung môi
20.5 26.28 38.83 46.38 50.68 0 20 40 60
N - hexan Cloroform Etyl Acetat Ethanol Methanol
Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo dung môi STT Tên dung
môi
Khối lượng cao chiết thu
được (g) Hiệu suất thu hồi (%)
1 N - hexan 3, 076 20,50 2 Cloroform 3, 942 26,28 3 Etyl Acetat 5, 825 38,83 4 Ethanol 6, 957 46,38 5 Methanol 7, 602 50,68 (%)
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Mặc dù đều là các dung môi khá rẻ tiền và cho khả năng trích ly cao lá xoài tốt hơn, nhưng Methanol là một dung môi độc, không thân thiện với môi trường. Chính vì thế ta chọn dung môi là Ethanol. Ưu điểm của dung môi này là rẻ tiền, ít độc, thân thiện với môi trường sống và dễ thu hồi.
3.1.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Trong quá trình trích ly, sử dụng lượng dung môi càng lớn thì hiệu quả trích ly càng cao do khả năng khuếch tán của cấu tử vào dung môi càng lớn. [Nguyễn Bin, 2005]. Tuy nhiên, ở một ngưỡng nhất định nào đó hiệu suất thu hồi sẽ tăng lên không đáng kể dù lượng dung môi tiếp tục tăng. Đồng thời, việc sử dụng nhiều dung môi lại gây tốn dung môi, tốn thời gian và năng lượng để đuổi dung môi sau trích ly. Do đó, việc xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là yếu tố rất cần thiết. Các tỷ lệ lần lượt được khảo sát là 1/7, 1/8, 1/9 và 1/10, 1/11 và 1/12. Kết quả được thể hiện như bảng 3.2 sau:
Bảng 3. 2 Tỉ lệ cao chiết thu được theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi STT Tỷ lệ nguyên
liệu/dung môi
Khối lượng cao chiết thu được (g)
Hiệu suất thu hồi (%) 1 1/7 4,731 31,54 2 1/8 5,823 38,82 3 1/9 6,826 45,51 4 1/10 7,069 47,13 5 1/11 7,074 47,16 6 1/12 7,082 47,21
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Hình 3. 2 Biểu đồ tương quan giữa tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và khối lượng cao chiết thu được
Theo biểu đồ hình 3.2 ta thấy khối lượng cao chiết thu được có xu hướng tăng dần khi ta tăng dần lượng dung môi đưa vào. Khi thể tích dung môi tăng lên, các phân tử tạo cao chiết càng có điều kiện thuận lợi để khuếch tán vào trong dung dịch. Tuy nhiên, lượng dung môi đạt đến một giá trị nhất định thì hiệu suất cao chiết thu được không có sự thay đổi nhiều. Ở đây, khi tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đạt 1/10 và 1/12 thì hiệu suất cao chiết lần lượt là 47,16% và 47,21% thể hiện xu hướng giảm và chững lại. Giá trị này có ý nghĩa về mặt thống kê, hiệu suất thu cao chiết thay đổi nhưng không đáng kể khi tiếp tục lượng dung môi thêm vào. Do đó, để đảm bảo tính kinh tế và thời gian thích hợp nhất, tôi lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 cho tiến trình nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Kết quả khảo sát nồng độ của dung môi :
Khi sử dụng dung môi là Ethanol (cồn) chúng ta có thể pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau. Điều này nhằm thay đổi độ phân cực của dung môi gần sát hơn với độ phân cực của các hợp chất thiên nhiên có trong lá xoài, giúp việc chiết tách dễ dàng hơn và khối lượng cao chiết thu được cũng cao hơn. Bên cạnh đó, phương pháp
31.54 38.82 45.51 47.13 47.16 47.21 0 10 20 30 40 50 1/7 1/8 1/9 1/10 1/11 1/12
Biểu đồ tỉ lệ cao chiết thu được theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
ngâm dầm cần sử dụng một lượng lớn dung môi nên pha loãng sẽ giúp ta tiết kiệm dung môi và kinh phí. Trong nội dung bài đồ án này, ta khảo sát các nồng độ dung môi khác nhau là 96%,90%,80%,70% và 60%. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới đây :
Bảng 3. 3 Tỉ lệ khối lượng cao chiết thu được theo nồng độ dung môi
STT Nồng độ dung môi Khối lượng cao chiết thu được (g)
Hiệu suất thu hồi (%) 1 96% 6,931 (46,21%) 46,21 2 90% 6,919 (46,13%) 46,13 3 80% 6,916 (46,11%) 46,11 4 70% 6,811 (45,41%) 45,41 5 60% 6,769 (45,13%) 45,13
Hình 3. 3 Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dung môi và khối lượng cao chiết thu được
Ta có thể thấy qua hình 3.4 nồng độ dung môi ảnh hưởng đến khối lượng cao chiết thu được theo xu hướng là giảm dần. Điều này là do khi dung môi được pha loãng với nước, H+ trong nước rất linh động làm thay đổi tính phân cực của Etanol, giúp dung môi dễ dàng lôi kéo những hợp chất thiên nhiên ra khỏi nguyên liệu. Tuy
46.21 46.13 46.11 45.41 45.13 44.5 45 45.5 46 46.5 96% 90% 80% 70% 60%
Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dung môi và khối lượng cao chiết thu được
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
nhiên, nếu ta pha loãng đến một mức độ nào đó, độ phân cực của dung môi giảm mạnh, không còn tương thích với độ phân cực của các hợp chất ta cần tách trong lá thì hiệu suất chiết tách sẽ bị giảm rõ rệt (như trong hình là từ 46,11% giảm còn 45,41%). Bên cạnh đó, hình 3.4 cũng cho ta thấy các nồng độ dung môi Etanol từ 96% đến 80% cũng không có sự thay đôỉ đáng kể về hiệu suất tách chiết. Do đó ta chọn nồng độ dung môi Etanol là 80%.
3.1.4 Kết quả lựa chọn thời gian ngâm dầm :
Thời gian ngâm dầm phụ thuộc vào nguyên liệu, dung môi và nồng độ của dung môi. Thông thường, khi thời gian ngâm càng dài thì hiệu suất thu được cao chiết càng tăng. Tuy nhiên, đến một ngưỡng thời gian nhất định, việc tăng thời gian ngâm không làm tăng hiệu quả của việc tách cao chiết. Mặt khác, thời gian ngâm quá lâu còn làm tốn kém về mặt thời gian. Do vậy, xác định thời gian ngâm dầm thích hợp cũng là một yếu tố cần thiết. Việc khảo sát thời gian ngâm dầm được tiến hành theo 3 đợt, sau mỗi đơt khảo sát khoảng thời gian khảo sát thu hẹp dần nhằm tiết kiệm thời gian tìm điều kiện tối ưu cho quy trình. Hiệu quả thu cao chiết được trình bày theo số liệu của bảng 3.4 dưới đây.
Bảng 3. 4 Khối lượng cao chiết thu được theo thời gian ngâm dầm
STT Đợt khảo sát Thời gian ngâm dầm (h)
Khối lượng cao chiết thu được (g)
Hiệu suất thu hồi (%) 1 Lần 1 6 9 12 15 3, 421 5,212 7,078 7,235 22,80 34,75 ~ 47,16 48,23 2 3 4 5 Lần 2 10 12 6,024 7,075 40,16 ~47,16 6
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Cũng qua bảng 3.4 ta thấy thời gian ngâm dầm là 12h thích hợp nhất. Điều này thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 3.4 dưới đây với kết quả cân được từ 3 bảng 3.2, 3.3, 3.4. Riêng với mốc thời gian 12h ta tính trung bình cộng để tránh sai số nhiều:
Hình 3. 4 Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được 3.2 Kết quả định tính:
Phản ứng màu đặc trưng: [3]
Hoà tan cao chiết lá xoài bằng Etanol 80O, sau đó tiến hành định tính như chương 2:
- Ống 2 : Tác dụng với HCl đậm đặc, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu cam.
Có sự xuất hiện của Flavonoids.
- Ống 3 : Tác dụng với FeCl3, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu xanh đậm.
Có sự xuất hiện của Alkaloids. 22.8 34.75 40.16 47.1 47.16 47.86 47.13 48.23 0 10 20 30 40 50 60 6h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được
(%) 7 14 7,070 47,13 8 Lần 3 11 12 13 7,065 7,074 7,180 47,10 ~47,16 47,86 9 10
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
- Ống 4 : Tác dụng với HCl và một ít bột Mg, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng xanh.
Có sự hiện diện của Mangiferin.
- Ống 5 : Tác dụng với NaOH 5%, dung dịch từ màu vàng nhạt trở nên đậm hơn.
Có sự xuất hiện của Antraglycoside.
Hình 3. 5: Phản ứng màu đặc trưng
Nhận ra sự có mặt của C=O, OH của phenol, phản ứng đặc trưng của một Alkaloid, Flavonoid, Antraglycosid thường thấy trong các hợp chất thiên nhiên.
3.3 Kết quả xác định cấu tử bằng GCMS
Trong nghiên cứu này, thành phần hóa học của cao lá xoài được xác định bởi quang phổ GCMS vì phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, có thể phát hiện và phân tích tổng quát để sàng lọc và so sánh các hoạt chất khác nhau.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Cao lá Xoài chiết bằng n-hexane
TT Rt Tên chất Hàm lượng Mass Độ tương hợp
khối phổ 1 4.043 Diacetone alcohol 5.704 116 906 2 14.517 Neophytadiene 11.99 278 915 3 14.566 Hexa-hydro-farnesol 3.166 228 830 4 14.717 3,7,11,15-tetramethyl-2- hexadecen-1-ol 2.187 296 874 5 14.879 3-Octadecyne 3.782 250 827 6 15.522 Palmitic acid 1.089 256 827 7 17.161 Phytol 1.474 296 837 8 17.433 Linolenic acid 6.100 278 852 9 20.259 Lupeol 36.18 426 826 10 20.616 Diethylhexyl adipate 9.707 370 845 11 24.587 Methyl (Z)-5,11,14,17- eicosatetraenoate 1.386 318 768 12 25.252 Dioctyl terephthalate 8.631 390 844 13 26.332 Squalene 1.862 410 831 14 34.468 -Sitosterol 3.227 414 744
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Kết quả quang phổ GCMS được so sánh với dữ liệu theo tài liệu tham khảo [7], tại các peak đặc trưng 15,888 (0,423%); 17,433 (6.1%); 20,16 (9,707%); và 24,587 (1,386%) cho thấy kết quả chiết cao lá xoài thể hiện các peak đặc trưng tương đối gần. Tuy nhiên, các dữ liệu này không quá sát với kết quả tài liệu tham khảo, điều này có thể giải thích do quá trình chiết chưa thực hiện được chính xác giai đoạn tạo tinh lá xoài, sản phẩm còn lẫn nhiều tạp chất, dẫn đến nhiều sai lệch trong kết quả đo quang phổ.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
3.4 Hoạt tính của cao chiết lá xoài tách được:
3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn :
Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá xoài được khảo sát bằng phương pháp đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết càng mạnh và ngược lại.
Bảng 3. 5: Đường kính vòng kháng khuẩn STT Nồng độ Đường kính vòng tròn kháng khuẩn (mm) Samonella Bacillus cereus E.
Coli Staphylococus Pseudomonas
1 Tetracylin 12 4 11 9 8
2 Ampicillin - 7 6 - 7
3 DMSO 5% - - - - -
Cao lá xoài tươi
4 1600mg/ml 4,3 4,5 5,5 5 4,3
5 800mg/ml 2,16 1,5 2,66 2,83 2,5
6 400mg/ml 1,16 1,25 1,13 1 1,25
7 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,8
Cao lá xoài khô
1 1600mg/ml 4,15 4,2 5,33 4,32 4,12
2 800mg/ml 2,12 1,33 2,60 2,75 2,13
3 400mg/ml 1,10 1,20 1,10 0,90 1,22
4 200mg/ml - 0,72 0,62 0,72 0,73
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
1 1600mg/ml 4,05 4 5,2 4,3 4,1
2 800mg/ml 2,10 1,2 2,50 2,55 2,2
3 400mg/ml 1,12 1,20 1,12 0,9 1,15
4 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,7
Chú thích: “-“ có nghĩa không có khả năng kháng khuẩn, kết quả 0,02mm
Số liệu khảo sát đường kính vòng kháng khuẩn áp dụng cho 5 loại khuẩn khá phổ biến đó là: Samonella, Bacillus cereus, E. Coli, Staphylococcus và Pseudomonas. Số liệu cung cấp về khảo sát ở điều kiện tương tự với 3 hoạt chất khác là: dạng cao chiết lá khô, dạng cao chiết lá tươi và dạng bột của cao chiết để so sánh. Kết quả khảo sát được trình bày như bảng 3.7 cho thấy tất cả 3 dạng cao chiết từ lá xoài đều có khả năng kháng các vi khuẩn đã lựa chọn và khả năng kháng khuẩn tăng dần theo nồng độ cao chiết tăng, Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ái Lan khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao lá xoài non [hiệu quả hạ glucose
huyết của cao chiết lá xoài non (mangifera indica l.) trên chuột bệnh đái tháo đường].
Tuy nhiên, dữ liệu nêu trên cũng cho thấy dạng cao chiết thay đổi (cao hoặc bột) không làm ảnh hưởng đến độ mạnh yếu của khả năng kháng khuẩn của hợp chất do đường kính vòng tròn vô khuẩn dao động trong khoảng nhỏ. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu lá tươi cho cao chiết lá có khả năng kháng khuẩn tốt hơn, có thể do trong