2. Kiến thức chuyên môn:
3.1.4 Kết quả lựa chọn thời gian ngâm dầ m:
Thời gian ngâm dầm phụ thuộc vào nguyên liệu, dung môi và nồng độ của dung môi. Thông thường, khi thời gian ngâm càng dài thì hiệu suất thu được cao chiết càng tăng. Tuy nhiên, đến một ngưỡng thời gian nhất định, việc tăng thời gian ngâm không làm tăng hiệu quả của việc tách cao chiết. Mặt khác, thời gian ngâm quá lâu còn làm tốn kém về mặt thời gian. Do vậy, xác định thời gian ngâm dầm thích hợp cũng là một yếu tố cần thiết. Việc khảo sát thời gian ngâm dầm được tiến hành theo 3 đợt, sau mỗi đơt khảo sát khoảng thời gian khảo sát thu hẹp dần nhằm tiết kiệm thời gian tìm điều kiện tối ưu cho quy trình. Hiệu quả thu cao chiết được trình bày theo số liệu của bảng 3.4 dưới đây.
Bảng 3. 4 Khối lượng cao chiết thu được theo thời gian ngâm dầm
STT Đợt khảo sát Thời gian ngâm dầm (h)
Khối lượng cao chiết thu được (g)
Hiệu suất thu hồi (%) 1 Lần 1 6 9 12 15 3, 421 5,212 7,078 7,235 22,80 34,75 ~ 47,16 48,23 2 3 4 5 Lần 2 10 12 6,024 7,075 40,16 ~47,16 6
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Cũng qua bảng 3.4 ta thấy thời gian ngâm dầm là 12h thích hợp nhất. Điều này thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 3.4 dưới đây với kết quả cân được từ 3 bảng 3.2, 3.3, 3.4. Riêng với mốc thời gian 12h ta tính trung bình cộng để tránh sai số nhiều:
Hình 3. 4 Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được 3.2 Kết quả định tính:
Phản ứng màu đặc trưng: [3]
Hoà tan cao chiết lá xoài bằng Etanol 80O, sau đó tiến hành định tính như chương 2:
- Ống 2 : Tác dụng với HCl đậm đặc, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu cam.
Có sự xuất hiện của Flavonoids.
- Ống 3 : Tác dụng với FeCl3, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu xanh đậm.
Có sự xuất hiện của Alkaloids. 22.8 34.75 40.16 47.1 47.16 47.86 47.13 48.23 0 10 20 30 40 50 60 6h 9h 10h 11h 12h 13h 14h 15h
Biểu đồ tương quan giữa thời gian ngâm dầm và khối lượng cao chiết thu được
(%) 7 14 7,070 47,13 8 Lần 3 11 12 13 7,065 7,074 7,180 47,10 ~47,16 47,86 9 10
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
- Ống 4 : Tác dụng với HCl và một ít bột Mg, dung dịch từ màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng xanh.
Có sự hiện diện của Mangiferin.
- Ống 5 : Tác dụng với NaOH 5%, dung dịch từ màu vàng nhạt trở nên đậm hơn.
Có sự xuất hiện của Antraglycoside.
Hình 3. 5: Phản ứng màu đặc trưng
Nhận ra sự có mặt của C=O, OH của phenol, phản ứng đặc trưng của một Alkaloid, Flavonoid, Antraglycosid thường thấy trong các hợp chất thiên nhiên.
3.3 Kết quả xác định cấu tử bằng GCMS
Trong nghiên cứu này, thành phần hóa học của cao lá xoài được xác định bởi quang phổ GCMS vì phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, có thể phát hiện và phân tích tổng quát để sàng lọc và so sánh các hoạt chất khác nhau.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Cao lá Xoài chiết bằng n-hexane
TT Rt Tên chất Hàm lượng Mass Độ tương hợp
khối phổ 1 4.043 Diacetone alcohol 5.704 116 906 2 14.517 Neophytadiene 11.99 278 915 3 14.566 Hexa-hydro-farnesol 3.166 228 830 4 14.717 3,7,11,15-tetramethyl-2- hexadecen-1-ol 2.187 296 874 5 14.879 3-Octadecyne 3.782 250 827 6 15.522 Palmitic acid 1.089 256 827 7 17.161 Phytol 1.474 296 837 8 17.433 Linolenic acid 6.100 278 852 9 20.259 Lupeol 36.18 426 826 10 20.616 Diethylhexyl adipate 9.707 370 845 11 24.587 Methyl (Z)-5,11,14,17- eicosatetraenoate 1.386 318 768 12 25.252 Dioctyl terephthalate 8.631 390 844 13 26.332 Squalene 1.862 410 831 14 34.468 -Sitosterol 3.227 414 744
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Kết quả quang phổ GCMS được so sánh với dữ liệu theo tài liệu tham khảo [7], tại các peak đặc trưng 15,888 (0,423%); 17,433 (6.1%); 20,16 (9,707%); và 24,587 (1,386%) cho thấy kết quả chiết cao lá xoài thể hiện các peak đặc trưng tương đối gần. Tuy nhiên, các dữ liệu này không quá sát với kết quả tài liệu tham khảo, điều này có thể giải thích do quá trình chiết chưa thực hiện được chính xác giai đoạn tạo tinh lá xoài, sản phẩm còn lẫn nhiều tạp chất, dẫn đến nhiều sai lệch trong kết quả đo quang phổ.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
3.4 Hoạt tính của cao chiết lá xoài tách được:
3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn :
Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá xoài được khảo sát bằng phương pháp đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn càng lớn thì hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết càng mạnh và ngược lại.
Bảng 3. 5: Đường kính vòng kháng khuẩn STT Nồng độ Đường kính vòng tròn kháng khuẩn (mm) Samonella Bacillus cereus E.
Coli Staphylococus Pseudomonas
1 Tetracylin 12 4 11 9 8
2 Ampicillin - 7 6 - 7
3 DMSO 5% - - - - -
Cao lá xoài tươi
4 1600mg/ml 4,3 4,5 5,5 5 4,3
5 800mg/ml 2,16 1,5 2,66 2,83 2,5
6 400mg/ml 1,16 1,25 1,13 1 1,25
7 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,8
Cao lá xoài khô
1 1600mg/ml 4,15 4,2 5,33 4,32 4,12
2 800mg/ml 2,12 1,33 2,60 2,75 2,13
3 400mg/ml 1,10 1,20 1,10 0,90 1,22
4 200mg/ml - 0,72 0,62 0,72 0,73
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
1 1600mg/ml 4,05 4 5,2 4,3 4,1
2 800mg/ml 2,10 1,2 2,50 2,55 2,2
3 400mg/ml 1,12 1,20 1,12 0,9 1,15
4 200mg/ml - 0,75 0,66 0,75 0,7
Chú thích: “-“ có nghĩa không có khả năng kháng khuẩn, kết quả 0,02mm
Số liệu khảo sát đường kính vòng kháng khuẩn áp dụng cho 5 loại khuẩn khá phổ biến đó là: Samonella, Bacillus cereus, E. Coli, Staphylococcus và Pseudomonas. Số liệu cung cấp về khảo sát ở điều kiện tương tự với 3 hoạt chất khác là: dạng cao chiết lá khô, dạng cao chiết lá tươi và dạng bột của cao chiết để so sánh. Kết quả khảo sát được trình bày như bảng 3.7 cho thấy tất cả 3 dạng cao chiết từ lá xoài đều có khả năng kháng các vi khuẩn đã lựa chọn và khả năng kháng khuẩn tăng dần theo nồng độ cao chiết tăng, Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ái Lan khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao lá xoài non [hiệu quả hạ glucose
huyết của cao chiết lá xoài non (mangifera indica l.) trên chuột bệnh đái tháo đường].
Tuy nhiên, dữ liệu nêu trên cũng cho thấy dạng cao chiết thay đổi (cao hoặc bột) không làm ảnh hưởng đến độ mạnh yếu của khả năng kháng khuẩn của hợp chất do đường kính vòng tròn vô khuẩn dao động trong khoảng nhỏ. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu lá tươi cho cao chiết lá có khả năng kháng khuẩn tốt hơn, có thể do trong lá tươi có chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn hơn từ hợp chất nhóm phenolic và flavonoid. Việc sử dụng nguồn nguyên liệu lá khô có thể khiến hàm lượng này hao hụt bớt. Tuy nhiên, việc đánh giá này cần những số liệu sâu hơn về hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng.
Đối với các chủng khuẩn khác nhau, độ mạnh yếu của khả năng kháng khuẩn thể hiện khá rõ nét. Ở nồng độ thấp, 200mg/ml cao lá xoài không có khả năng kháng
Samonella, đối với các chủng khuẩn còn lại, hoạt tính kháng khuẩn cũng thể hiện yếu
không rõ ràng. Tuy nhiên, với hoạt chất thương mại như Ampicilin cũng không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn do Samonella là một chủng khuẩn tương đối mạnh. Khi
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
nồng độ cao chiết tăng lên 8 lần (1600mg/ml), độ mạnh của vòng kháng khuẩn tăng lên đáng kể, so với Ampicilin (không kháng Samonella và E. Coli) thì khả năng kháng
Bacillus cereus, Staphylococus, Pseudomonas lần lượt là 7 ± 0,3 mm, … thì khả năng
kháng khuẩn của cao chiết lá xoài đạt khoảng 60 %. So với Tetracylin (cũng có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn) thì hoạt chất kháng khuẩn của cao lá xoài chỉ đạt khoảng 30%.
Với những dữ liệu hiện tại, hoạt tính kháng khuẩn của cao lá xoài thể hiễn rõ, đa dạng với các chủng khuẩn, tuy nhiên cần có các phương pháp thử chuyên sâu hơn để đưa ra những kết luận rõ ràng hơn.
Cao lá tươi Cao lá khô Bột lá xoài
Samonella
Bacillus cereus
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Staphylococus
Pseudomonas
Hình 3. 9: Kết quả đo vòng kháng khuẩn
Nhận xét: Qua bảng 3.8 ta nhận thấy khả năng kháng khuẩn giảm dần từ dạng cao lá tươi, đến cao lá khô và cuối cùng là dạng bột. điều này có thể lí giải do quá trình tạo cao chiết lá khô hoặc dạng bột chúng ta sử dụng nhiệt độ quá nhiều lần làm phân huỷ, mất đi hoặc biến tính khả năng kháng khuẩn của các hợp chất thiên nhiên có trong lá, làm giảm đi tính kháng khuẩn. Bên cạnh đó, ta cũng thấy xu hướng kháng khuẩn cũng giảm theo chiều giảm của nồng độ cao chiết. Riêng với khuẩn Samonella nồng độ 200 uml/mg không thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn. Điều này là do nồng độ của cao chiết lá quá thấp và Samonella cũng là một dòng khuẩn mạnh. Cả 3 dạng chiết đều kháng khuẩn E. Coli, Staphylococcus Aureus mạnh nhất ( > 5mm), nguyên nhân là do trong các dạng chiết này có thể đều chứa hàm lượng lớn Mangiferin, là một hợp chất có tính kháng khuẩn E. Coli và Staphylococcus Aureus mạnh với mức nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) lần lượt là 6,25mg/ml và 50 mg/ml [1].
3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa
Các chất kháng oxy hoá tự nhiên thường là hỗn hợp của nhiều cấu tử có cấu trúc hóa học và nhóm chức khác nhau, vì vậy chúng thường kháng oxy hóa theo nhiều chức năng và phương thức khác nhau. Do đó, một phương pháp đánh giá (một mô hình khảo sát) chỉ mô tả một khía cạnh nào đó của khả năng kháng oxy hóa. Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng phương pháp phosphomolybdenum.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Bảng 3. 6: Mật độ quang của đường chuẩn acid gallic
C (𝝁g/ml) 10 20 30 40 50
A
(mg/ml) 0,217 0.301 0.432 0.576 0.709
Hình 3. 10: Biểu đồ phương trình đường chuấn Acid Galic Bảng 3. 7: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ
Một số loại lá Mật độ quang Lá Chè xanh 9,3 Lá Lô hội 1,371 Lá Neem 0.93 Lá Xoài 0.413 0.217 0.301 0.432 0.576 0.709 y = 0.1259x + 0.0693 R² = 0.99238 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 10 20 30 40 50
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
Hình 3. 11: So sánh độ hấp thụ quang của một số lá
Nhận xét: Ở các loại lá, độ hấp thụ quang ở nồng độ 10 𝜇g/ml của cao lá Chè xanh cao nên lực kháng oxy hóa của cao lá Chè xanh vượt trội so với các lá còn lại. Cao lá xoài có lực kháng oxy hóa thấp nhất, thấp hơn lá Neem và lá Lô Hội. Nhưng tóm lại cao lá xoài vẫn có khả năng kháng oxy hoá (cần được khảo sát thêm về tiềm năng kháng oxy hóa theo các nồng độ khác nhau và bằng các phương pháp khác).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
lá chè xanh lá lô hội lá neem lá xoài
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
a. Kết luận
Cao chiết lá xoài được chiết được chiết xuất với dung môi Ethanol 80%, với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10 và được ngâm dầm trong 12h sẽ cho hiệu suất cao chiết thu được cao nhất.
Hiệu suất thu được gần 47,16%.
Cao chiết lá xoài có chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên như carbonhydrate, Tannin, Akaloids, saponin, steroid, glycoside, flavonoids và protein có tác dụng chống viêm, trị kiết lị, tiêu chảy, cầm máu, rửa vết thương, kháng khuẩn nấm có thể sử dụng trong thuốc bôi da, trị rối loạn đường ruột… với nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm, thân thiện với môi trường sống, hoá chất dễ thu hồi có thể dễ dàng áp dụng và công nghiệp với quy mô lớn.
b. Kiến nghị
Chính vì tiềm năng to lớn về mặt y học và nguyên liệu dễ tìm trong tỉnh BRVT nhưng chưa được khai thác triệt để nhằm mang lại những phương thuốc mới được chiết xuất từ các hợp chất thiên nhiên, thay thế cho kháng sinh trong tương lai và đem lại lợi ích kinh tế từ lá xoài – một thứ xưa nay bị xem là phế phẩm của nông nghiệp- cho tỉnh nhà, chúng ta nên tiếp tục nghiên cứu và phát huy đề tài theo những hướng xa hơn, sâu rộng hơn trong nhiều lĩnh vực, điển hìn
- Tối ưu phương pháp chiết tách và tạo cao chiết để đạt được hiệu suất cao hơn trong thời gian ngắn hơn, để dễ dàng đưa vào quy mô công nghiệp.
- Nghiên cứu tìm ra cho hết tất cả các hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết lá xoài có ích đối với con người, áp dụng vào y – dược học.
Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Đồ án – Khóa 2015-2019
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Hoá Dược – Mangiferin, Hội đồng dược điển Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển – Viện Dược Liệu, Vũ Ngọc Lỗ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, năm 2004. Cây Thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà Xuất Bản khoa học và Kĩ thuật Hà Nội, tập II, trang 1015 – 1020.
3. Nguyễn Kim Phi Phụng, năm 2007, Phương pháp cô lập chất hữu cơ. Nhà
xuất bản Đại học Quốc Gia, thành phố Hồ Chí Minh, 20 – 21.
4. Nguyễn Viết Tựu -Phân viện Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh. Quy trình công nghệ chiết xuất mangiferin từ lá xoài. Tạp chí dược liệu tập 1, số 2/1996 trang 56-57.
5. Phạm Gia Khôi và Phạm Xuân Sinh (1991), “Nghiên cứu chiết xuất vả xác định Flavonoid mangiferin trong lá xoài”, Tạp chí dược học (số 5), 8, 19 6. Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, 2012, Hà Nội
7. Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ Đào Thắng, Trần Văn Sung, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, Viện Hóa học-Viện Khoa học và Công Nghê Việt Nam, “ Các kết quả tiếp theo về thành phần hóa học của cây Chóc máu Salacia Chinensis”, Tạp chí Hóa học, T.47 (4A), trang 192 - 196, 2009. 8. Trần Thị Phương Anh, Nguyễn Tiến Bân, Lê Kim Biên (2003), Danh mục
các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
9. Trương Thế Quang, Giáo trình Tin thống kê sinh học (Biostatistical Informatics), Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Dân Lập Văn Lang, trang 32-33
10.Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, NXB Giáo Dục, Hà