CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký
Sắc ký là kỹ thuật tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử riêng rẽ dựa
trên ái lực khác nhau của các cấu tử này giữa 2 pha khơng trộn lẫn, trong đó một pha đứng yên (được gọi là pha tĩnh) và một pha còn lại là pha động.
Pha tĩnh có thể là các hạt rắn xốp, mịn hay cũng có thể là pha lỏng được gắn kết trên bề mặt của các hạt giá thể rắn nào đó. Pha tĩnh có thể được nhồi vào một cột bằng thủy tinh hay inox (sắc ký cột) hoặc tráng trên bản mỏng (bằng nhựa hay nhôm). Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ, là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion, là chất lỏng ta có sắc ký phân bố, là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.
Để rửa giải chất phân tích ra khỏi pha tĩnh cần có một pha động. Pha động ở trạng thái lỏng (gọi là sắc ký lỏng), trạng thái khí (sắc ký khí) hay trạng thái siêu tới hạn (sắc ký siêu tới hạn).
Trong quá trình sắc ký, mẫu phân tích được nạp lên đầu cột pha tĩnh, sau đó cho pha động dịch chuyển liên tục qua pha tĩnh. Trong q trình này, cấu tử nào có ái lực với pha tĩnh càng mạnh sẽ bị lưu giữ càng chặt trên pha tĩnh, do đó tốc độ di chuyển càng chậm. Ngược lại, cấu tử có ái lực yếu với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn. Nếu chiều dài pha tĩnh đủ lớn thì sau một thời gian các cấu tử phân tích sẽ được tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Q trình tách hỗn hợp phân tích được lưu giữ trên pha tĩnh bằng cách cho một pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh như trên được gọi là sự rửa giải. Nếu đầu ra của cột sắc ký được ghép nối với một detector có khả năng ghi nhận một tín hiệu vật lý đặc trưng nào đó của các cấu tử phân tích (ví dụ: độ hấp thụ ánh sáng, chiết suất, độ dẫn điện, cường độ phát huỳnh quang, ...) và biểu diễn sự thay đổi của nồng độ chất phân tích (Cx) theo thời gian rửa giải (t), ta sẽ thu một sắc ký đồ chứa các peak sắc ký (Hình 1.4).
Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [38]
Trong sắc ký cột cổ điển sử dụng pha động là pha lỏng (sắc ký lỏng), kích thước các hạt pha tĩnh vào khoảng 50 – 230 µm. Thực tế cho thấy với kích thước hạt pha tĩnh như vậy hiệu quả tách không cao, thường chỉ cho phép tách những hỗn hợp chứa ít cấu tử và có ái lực với pha tĩnh khác nhau khá nhiều. Để tách những hỗn hợp cấu tử phức tạp (chứa nhiều cấu tử hoặc ái lực với pha tĩnh khác nhau không nhiều) cần tăng chiều dài đường đi của các cấu tử trên pha tĩnh bằng cách giảm kích thước các hạt pha tĩnh xuống khoảng 3 - 5 μm. Tuy nhiên, khi đó pha tĩnh được nén rất chặt nên phải hệ thống bơm
cao áp để đẩy pha động đi qua cột pha tĩnh. Kết quả là hình thành một kỹ thuật sắc ký mới là sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography) hay chính xác hơn là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography), viết tắt là HPLC.