CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein
a) Xác định độ tinh khiết của mẫu lutein đối chứng: lutein dễ phân hủy
trong quá trình bảo quản nên trước khi dựng đường chuẩn cần xác định lại hàm lượng lutein trong mẫu đối chứng dựa vào phương pháp của JECFA (2004) [12]. Cụ thể như sau:
Bước 1: Xác định hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu lutein đối chứng:
Cân chính xác một lượng lutein đối chứng trên cân phân tích (khoảng 27 - 35 mg) cho vào bình định mức 100 ml. Thêm vào đó vài giọt dichloromethane và đảo đều đến khi thấy tinh thể vừa tan, rồi pha loãng và định mức đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 10 phút.
Hút 1 mL dung dịch lutein thu được cho vào bình định mức 100 mL thứ hai, pha lỗng đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 20 giây. Đo độ hấp thụ của dung dịch vừa thu được ở 446 nm với cuvet 1cm (dùng ethanol tuyệt đối làm dung dịch so sánh).
Hàm lượng carotenoid tổng số (% CARTS) trong mẫu lutein đối chứng được tính theo cơng thức:
%CARTS = A
446 .D
E11cm% .G
trong đó:
D = 100*100 = 104 là độ pha loãng dung dịch lutein trong ethanol A446: độ hấp thụ của dung dịch lutein đo được
E11cm% = 2550: độ hấp thụ của dung dịch lutein tinh khiết trong dung môi
ethanol ở 446 nm đo với cuvet 1 cm
G: lượng lutein đem phân tích (tính bằng g)
Hút 1 mL dung dịch lutein trong ethanol thu được ở trên cho vào bình định mức 50 ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng acetone HPLC, lắc đều. Hút 1 ml dung dịch thu được lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC đang sử dụng với cột phân tích C18 (250x 4,6; 5 µm), detector DAD (ghi tín hiệu ở 446 nm), pha động là hỗn hợp MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v), rửa giải isocratic trong 10 phút với tốc độ dòng 1 ml/phút.
Hàm lượng lutein trong tổng số carotenoid có trong mẫu lutein đối chứng được tính theo cơng thức:
%Lutein = %CARTS . SLutein S
TS
trong đó:
SLutein và STS lần lượt là diện tích peak lutein và tổng diện tích tất cả các peak có trên sắc ký đồ
b) Dựng đường chuẩn lutein: - Pha dung dịch chuẩn gốc lutein:
Cân 0,0276 gam lutein đối chứng (vừa xác định hàm lượng lutein như trên) hòa tan và định mức đến 250 mL bằng acetone.
- Pha dãy chuẩn lutein chạy HPLC:
Từ dung dịch chuẩn gốc lutein vừa pha, hút lần lượt 1,25; 2,50; 5,00; 7,50 và 10,00 (mL) cho vào 5 bình định mức 25 mL (ký hiệu lần lượt là S1, S2, S3, S4, S5), rồi pha lỗng đến vạch mức bằng acetone HPLC (có chứa 0,1% BHT). Lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC. Tiến hành phân tích theo điều kiện HPLC thích hợp đã chọn ở phần 2.3.1.2. Dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak lutein (S) và nồng độ lutein (C) của dãy chuẩn:
S = aC + b trong đó:
a và b lần lượt là hệ số góc và tung độ gốc của đường chuẩn Mỗi điểm chuẩn đo 3 lần để tính độ lệch chuẩn của a và b.
2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein