CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
ỞViệt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại. Đối với các cột pha đảo thì cột C30 tuy có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid khác nhau (đặc biệt là hỗn hợp carotenoid ở các dạng đồng phân khác nhau) nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn trong phân tích các hỗn hợp carotenoid khơng quá phức tạp. Cho tới nay số cơng trình nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng các hợp chất nhóm carotenoid rất ít.
Hồng Thị Huệ An (2009) [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định
lượng astaxanthin và các carotenoid đi kèm có trong một số lồi giáp xác thủy sản. Mẫu được xay nhỏ, trộn đều với Na2SO4 khan rồi đồng hóa trong dung mơi acetone. Dịch chiết acetone được chiết sang hỗn hợp ether ethylic - ether dầu mỏ (1:1, v/v), làm khan, cô quay, hòa tan trong methanol- dichloromethane (3:1, v/v) và xà phịng hóa ở 50C trong 18 giờ (phương pháp
ethyl axetat, cơ quay. Hịa tan cặn thu được acetone, giữ qua đêm ở -200C để kết tủa tạp chất lipid, rồi lọc dung dịch qua màng lọc PTFE 0,22 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC (Agilent 1100 Series, USA). Điều kiện sắc ký như sau: cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột 300C; thể tích bơm mẫu: 5 µl; tốc độ dịng: 1 ml/min; detector PDA ghi tín hiệu ở 480 nm và quét phổ từ 350 – 600 nm. Rửa giải gradient (100% A: 8 phút; 100% A đến 100% B: 5 phút; 100% B 15 phút; cân bằng cột: 15 phút; trong đó A = acetonitrile-methanol- dichloromethane-H2O 85:5:5:5 v/v/v/v và B= acetonitrile-methanol- dichloromethane-H2O 60:8:30:2 v/v/v/v). Phương pháp cho phép tách tốt hỗn hợp astaxanthin, lutein/zeaxanthin, lycopene, b-carotene nhưng không phân tách được cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Kết quả cho thấy các đường chuẩn tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ carotenoid từ 1,5 - 10 µg/ml (R2 > 0,99); độ lặp lại cao (%RSD = 0,30 – 1,50% đối với mẫu chuẩn (n = 6) đo trong ngày có n = 6 và từ 1,13 - 2,93% đối với mẫu chuẩn (n = 3) trong 2 tháng. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi thấp (astaxanthin: 83%; lutein: 65,4%; lycopene: 52,4%; b-carotene: 66,4%) do carotenoid bị mất mát trong q trình xà phịng hóa và kết tủa tạp chất lipid bằng acetone.
Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ (2017) [14] đã xây dựng
phương pháp phân tích β – carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng phương pháp HPLC với detector PDA sử dụng cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) ở nhiệt độ phịng. Pha động là MeOH:H2O 50:50 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả nghiên cứu cho thấy : phương pháp có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt (RSD% < 3,5%, n = 6); LOD thấp (0,2 ppm); đường chuẩn β – carotene tuyến tính tốt trong khoảng 0,5 ÷ 10 ppm (R2 = 0,9999); độ đúng tốt (độ thu hồi trên mẫu thực tế từ 91 ÷ 101%).
Tuy đã có nhiều phương pháp định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 nhưng các phương pháp này khơng phù hợp với điều kiện sẵn có ở phịng thí nghiệm của chúng tơi (hoặc về các thơng số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động, hoặc về phạm vi ứng dụng…). Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC sẵn
có để phù hợp hơn với điều kiện phịng thí nghiệm và mục đích phân tích cụ thể là điều cần thiết.
Trong đề tài này sẽ sử dụng thiết bị HPLC-DAD và cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) - là cột pha đảo C18 duy nhất có tại phịng thí nghiệm của chúng tơi - để nghiên cứu định lượng lutein trong sự có mặt của một số carotenoid khác (astaxanthin, zeaxanthin; b-caroten; các lutein ester) từ đó ứng dụng xác định điều kiện thích hợp cho phản ứng xà phịng hóa lutein ester tách chiết từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagteges erecta L.).