CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải
Thành phần pha động có ảnh hưởng đến q trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Khi thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích, qua đó làm thay đổi thừa số lưu giữ k’ của các cấu tử trong hỗn hợp phân tích. Vì vậy, để có được thành phần pha động phù hợp cần tiến hành thử nghiệm sắc ký với tỷ lệ dung mơi khác nhau.
Trong q trình nghiên cứu, các điều kiện sau đây được giữ cố định trong suốt q trình khảo sát (trường hợp có thay đổi sẽ được đề cập riêng):
- Cột phân tích TSKgel ODS-100V (250 mm x 4,6 mm; 5 μm);
- Nhiệt độ cột: 250C;
- Thể tích bơm mẫu: 20 µl; - Tốc độ dịng: 1 ml/phút;
- Detectơ PAD; bước sóng làm việc: 450 nm.
Các pha động được tổ hợp từ các dung môi acetonitrile (MeCN), methanol (MeOH), dichloromethane (DCM) và nước (H2O).
Trước hết, khảo sát 6 chế độ rửa giải isocratic với thành phần pha động thay đổi như sau (Bảng 2.1) :
Bảng 2.1. Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải
isocratic
Ký hiệu Thành phần pha động (v/v/v/v)
MeCN MeOH DCM H2O
I1 70 15 10 5 I2 45 40 10 5 I3 70 9 20 1 I4 50 9 40 1 I5 45 12 42 1 I6 45 14 40 1
Dựa vào các kết quả thu được, để hiệu quả tách tốt cần lựa chọn thành phần pha động và điều chỉnh chế độ rửa giải sao cho :
- Các cấu tử khảo sát có thừa số lưu giữ k’» 2 – 5 (nếu hỗn hợp phức tạp thì k’ = 1 – 20).
- 2 peak kế cận nhau có độ chọn lọc a ³ 1. - 2 peak kế cận nhau có độ phân giải Rs ³ 1,5. trong đó:
ki ' =tRi - t0 ; a = k'2 ; Rs = 2(tR 2 - tR1 )
t
0
k'1 (W1 +W2)
t0: thời gian chết, là giá trị trung bình cộng của thời gian xuất hiện peak
dung môi (thực nghiệm cho thấy hệ thống HPLC đang sử dụng có t0 » 3,1 phút).
tRi : thời gian lưu của cấu tử phân tích thứ i ; 1 và 2: hai cấu tử rửa giải kế cận nhau;