CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC
ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHỊNG HỐ LUTEIN ESTER ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ
Để khảo sát điều kiện thích hợp nhất khi tiến hành xà phịng hố lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ, ta cần đi khảo sát các điều kiện về ảnh hưởng của nồng độ lutein ester (oleoresin), nồng độ KOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất xà phịng hố.
3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin
Từ kết quả bảng 3.9 và hình 3.15, ta thấy rằng nồng độ oleoresin ảnh hưởng khơng nhỏ đến hiệu suất xà phịng hoá lutein ester.
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến
hiệu suất xà phịng hố.
Coleoresin KOH/Oleoresin Hiệu suất thu Hiệu suất thu Hiệu suất xà
(g/ml) (w/w) nhận trans- nhận cis- phịng hóa
lutein (%) lutein (%) tổng cộng (%) 0,1 1,50 15,10 2,98 18,08 0,2 0,75 16,78 4,75 21,53 0,3 0,50 17,41 4,97 22,38 0,4 0,38 15,82 6,14 21,96 0,5 0,30 20,10 5,54 25,64 0,6 0,25 50,68 12,40 63,08 0,8 0,19 77,32 15,49 92,81 0,9 0,17 32,15 9,60 41,75
Cis-Lutein 100 Tổng lutein (% ) 80 hó a xà phòn g 60 40 su ấ t H iệ u 20 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 C-Oleoresin (g/ml)
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin Nhận xét:
- Với nồng độ oleoresin thấp (với 0,1 – 0,5g/ml) tương ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin lớn (1,5 – 0,3 lần) ta nhận thấy rằng hiệu suất chuyển hoá của lutein ester thành lutein tự do (dạng trans, cis – hay tổng số) đều rất thấp. Điều này cho thấy lutein tự do bị phân huỷ khi có mặt của lượng kiềm dư khá lớn.
- Khi nồng độ oleoresin tăng lên thì hiệu suất xà phịng hố cũng tăng lên đáng kể, ở nồng độ oleoresin 0,8g/ml (tương ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin là 0,19) thì đạt cực đại nhưng sau đó lại giảm mạnh ở nồng độ 0,9g/ml. Thực nghiệm cho thấy rằng, khi tăng nồng độ oleoresin lên (>0,8g/ml) thì hỗn hợp rất đặc do đó việc khuấy trộn rất khó ngay cả khi nó được đun nóng đến 700C. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất xà phịng hố khi tăng nồng độ oleoresin là do sự giảm khả năng tiếp xúc các tác chất trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, để hiệu suất xà phịng hố lutein ester cao nhất nên chọn nồng độ oleoresin là 0,8g/ml.
3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phịng hóa
Kết quả thực nghiệm từ bảng 3.10 cho thấy, nồng độ KOH ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất xà phịng hóa lutein ester. Khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml thì hiệu suất phản ứng tăng mạnh khi nồng độ KOH tăng từ 0,00 – 0,05g/ml và sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nồng độ KOH .
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phịng hóa
lutein ester.
CKOH KOH/Oleoresin Hiệu suất thu Hiệu suất Hiệu suất xà (g/ml) (w/w) nhận trans- thu nhận cis- phịng hóa
lutein (%) lutein (%) tổng cộng (%) 0,000 0,00 0,00 0,00 0,00 0,025 0,08 18,95 5,21 24,15 0,050 0,17 56,88 9,22 66,10 0,100 0,33 53,35 5,21 58,56 0,150 0,50 16,74 4,53 21,27 0,200 0,67 11,20 2,52 13,72 0,250 0,83 8,90 2,74 11,63 0,300 1,00 4,12 1,34 5,45
Điều này được giải thích bởi sự phân huỷ lutein trong mơi trường kiềm dư. Chitta Ranjan Sarkar và cs. (2012) cũng đã đưa ra kết luận về sự suy giảm hiệu suất xà phòng hố lutein ester trong mơi trường kiềm khi xà phịng hoá lutein ester bằng KOH trong methanol.
Theo kết quả nghiên cứu trên (bảng 3.10), nhận thấy rằng để xà phịng hố lutein ester với nồng độ oleoresin được cố định là 0,3g/ml thì cần dùng nồng độ KOH trong ethanol là 0,05g/ml (tức 5% w/v hay 0,89M) tương ứng tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,17 w/w.
Trong khi đó, theo Swaminathan, điều kiện tối ưu để xà phịng hố lutein ester là nồng độ oleoresin 0,8g/ml với nồng độ KOH là 15% w/v (tức là 0,15g/ml hay 2,5M) ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin là 0,1875 w/w) [8] . Mặc dù, giá trị KOH tối ưu để xà phịng hố khác nhau nhiều nhưng giá trị tỷ lệ KOH/oleoresin tối ưu theo nghiên cứu của chúng tôi và Swaminathan lại khá gần nhau. Một điều thú vị nữa là nếu chúng ta biểu diễn kết quả nghiên cứu ở
KOH/oleoresin tối ưu vào khoảng 0,17 – 0,19, điều này trùng hợp với kết quả nghiên cứu của Swaminathan. Vì vậy, với tỷ lệ KOH/oleoresin tối ưu này thì tùy theo nồng độ oleoresin trong hỗn hợp mà phải dùng nồng độ KOH khác nhau. Điều đó giải thích tại sao nồng độ KOH tối ưu trong kết quả nghiên cứu của các tác giả khác nhau thường khơng giống nhau.
100 Trans-Lutein Cis-Lutein 0,19 Tổng lutein (% 80 hó a 0,25 xà phịn g 60 40 0,17 su ất 0,30 H iệ u 20 0,38 0,50 0,75 1,50 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 KOH/Oleoresin (w/w)
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phịng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin
khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml
100 Trans-Lutein Cis-Lutein hó a (% ) 80 Tổng Lutein 0,17 xà p hị ng 60 0,33 40 su ất H iệ u 20 0,08 0,50 0,67 0,83 1,00 0 0,00 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 KOH/Oleoresin (w/w)
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phịng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin
khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml
Như vậy, để hiệu suất xà phịng hóa lutein ester cao nhất nên tiến hành phản ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin khoảng 0,18 w/w. Khi đó, ứng với nồng độ
0,144 g/ml = 14,4% w/v = 2,58 M. Kết quả này khá tương đồng với điều kiện xà phịng hóa đề nghị bởi Swaminathan (2010).
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phịng hóa
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phịng hố thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.18.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phịng hóa. Nhiệt độ Hiệu suất thu Hiệu suất thu Hiệu suất xà phịng
(0C) nhận trans-lutein nhận hóa (%) cis-lutein (%) tổng cộng (%) 40 2,24 0,00 2,24 50 6,51 0,00 6,51 60 8,60 0,00 8,60 70 56,90 9,22 66,12 80 59,25 15,39 74,64 100 Trans-Lutein Cis-Lutein Tổng Lutein (% ) 80 74,64 66,12 60 59,25 xà phò ng 56,90 40 H iệ u su ất 20 15,39 6,51 8,60 9,22 2,24 6,51 8,60 0 2,24 0,00 0,00 0,00 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (độ C)
Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất xà phịng hóa lutein ester và chất lượng sản phẩm lutein tự do hình thành.
- Ở nhiệt độ 400C hiệu suất xà phịng hóa rất thấp (chỉ khoảng 2,24%) tại đó lượng lutein ester cịn lại rất lớn trong khi đó lượng lutein tự do hình thành khơng đáng kể. Điều đó thể hiện rõ ở sắc ký đồ hình 3.19.a). Thực nghiệm cho thấy ở 400C oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ là một khối lỏng đặc sệt, rất khó khuấy trộn. Khi được gia nhiệt, oleoresin dần dần chảy lỏng ra, dễ khuấy hơn.
- Khi tăng nhiệt độ từ 40 – 600C thì hiệu suất xà phịng hóa tăng lên nhưng chậm (từ 2,24% – 8,60%). Nếu tiếp tục tang nhiệt độ từ 60-700C thì hiệu suất phản ứng tăng rất mạnh (từ 8,6% – 66,12%) nhưng sau đó lại tăng chậm dần. Như vậy, khi tăng nhiệt độ xà phịng hố thì hiệu suất tăng có thể được giải thích bởi sự gia tăng khả năng tiếp xúc các tác chất (oleoresin và KOH) với nhau, nhờ đó tốc độ phản ứng tăng lên.
Các sắc ký đồ HPLC (Hình 3.19) cũng cho thấy ở nhiệt độ dưới 600C thì sản phẩm lutein tự do hình thành chỉ có đồng phân trans chứ khơng có đồng phân cis. Tuy nhiên, trên 600C thì đồng phân cis xuất hiện và tỷ lệ đồng phân cis/trans càng tăng khi nhiệt độ càng tăng. Do vậy, mặc dù hiệu suất xà phịng hóa ở 800C cao hơn ở 700C nhưng ở 800C tỷ lệ đồng phân cis trong hỗn hợp sản phẩm lutein tự do (khoảng 20%) cao hơn đáng kể so với tỷ lệ này ở 700C (khoảng 13,9%). Do vậy, để hiệu suất xà phịng hóa cao đồng thời bảo đảm hoạt tính sinh học của sản phẩm tương đối tốt, nên tiến hành xà phịng hóa ở 700C. Kết luận này cũng phù hợp với điều kiện về nhiệt độ xà phịng hóa lutein ester đã được đề nghị bởi Swaminathan (2009).
a) Ở 400C
b) Ở 500C
d) Ở 700C
e) Ở 800C
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phịng
hóa
Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phịng hố khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml; nồng độ KOH là 15% w/v; nhiệt độ 700C được thể hiện ở Bảng 3.12 và Hình 3.20.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phịng hóa lutein ester.
Thờigian Hiệu suất thu nhận Hiệu suất thu nhận Hiệu suất xà phịng hóa (min) trans-lutein (%) cis-lutein (%) tổng cộng (%)
0 0,00 0,00 0,00 20 54,98 11,10 66,07 40 57,70 10,55 68,25 60 61,54 13,20 74,74 80 67,65 14,30 81,95 100 57,93 14,08 72,01 120 55,12 15,56 70,68 180 41,70 10,60 52,29 100 Trans-Lutein Cis-Lutein Tổng-Lutein 80 l u t 60 th u nh ậ n 40 H iệ u su ất 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Thời gian (phút)
Từ kết quả khảo sát trên, cho thấy:
- Trong thời gian 20 phút đầu tiên hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do ở các dạng đồng phân trans, cis và tổng số đều tăng rất mạnh (từ 0% lên đến 66,07%). Các sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin ban đầu và sau khi xà phịng hóa (Hình 3.21a và Hình3.21b) cũng cho thấy chỉ sau 20 phút các peak lutein ester hầu như biến mất; ngược lại xuất hiện các peak
trans-lutein (RT ~ 9,3 phút) và cis-lutein (RT ~ 10,9 phút).
- Tiếp tục đun nóng từ 20 - 80 phút thì hiệu suất thu nhận lutein tự do dạng trans và lutein tổng số tăng lên nhưng với tốc độ chậm hơn và sau đó lại giảm đi nếu kéo dài thời gian phản ứng. Trong khi đó, hiệu suất hình thành dạng cis-lutein hầu như không thay đổi khi thời gian phản ứng tăng từ 20 – 180 phút. Điều này chứng tỏ ở 700C đồng phân cis-lutein tương đối bền, còn đồng phân trans kém bền hơn. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất thu nhận lutein dạng trans- nếu kéo dài thời gian xà phịng hố (trên 80 phút) là do sự chuyển hoá dạng đồng phân này sang dạng đồng phân cis- của lutein hoặc các dạng sản phẩm phân huỷ khác.
Theo kết quả nghiên cứu trên cho thấy thời gian thích hợp nhất để xà phịng hóa lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ ở 700C là 80 phút. Thời gian phản ứng này so với thời gian đề nghị bởi Swaminathan (2009) dài hơn 50 phút. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do trong quy trình của Swaminathan phản ứng xà phịng hóa được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn (từ 70-800C). Như đã nhận xét ở phần 3.5.3, việc tăng nhiệt độ phản ứng từ 70- 800C tuy có tác dụng làm tăng hiệu suất xà phịng hóa (nhờ vậy rút ngắn thời gian phản ứng) nhưng sẽ làm tăng tỷ lệ đồng phân cis- trong sản phẩm phản ứng, do đó làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm lutein thu nhận được. Do vậy, chúng tôi vẫn chọn nhiệt độ xà phịng hóa là 700C, ứng với thời gian xà phịng hóa 80 phút.
a) Mẫu chưa xà phịng hóa
b) Mẫu xà phịng hóa 20 phút
d) Mẫu xà phịng hố 60 phút
e) Mẫu xà phịng hố 80 phút
f) Mẫu xà phịng hố 100 phút
g) Mẫu xà phịng hố 120 phút
h) Mẫu xà phịng hố 180 phút
Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phịng hố trong các khoảng thời
3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phịng hố
Qua kết quả khảo sát điều kiện xà phịng hố trên để đạt để hiệu suất xà phịng hố cao, có thể rút ra một số kết luận sau:
-Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4% w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.
- Nhiệt độ xà phịng hố để đạt hiệu suất cao là 700C - Thời gian xà phịng hố là 80 phút
3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHỊNG HỐ
3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn
Kết quả thử nghiệm quy trình xà phịng hố cao chiết lutein ester trên mẫu lớn được thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phịng hố trên mẫu lớn. Mẫu đo Strans- Scis- Stổng CLutein tìm CLutein tổng
mLutein (g) thấy(ppm) (ppm) Mẫu 1 Lần 1 4695346 2202866 6898212 48,64 59,75 0,60 Lần 2 4604332 2005289 6609621 46,65 57,30 0,57 Lần 3 5351572 2196035 7547607 53,13 65,25 0,65 TB 49,47 60,77 0,61 %RSD 6,70 6,70 6,70 Mẫu 2 Lần 1 3915929 1608596 5524525 39,16 48,10 0,48 Lần 2 4131982 1515102 5647084 40,01 49,14 0,49 Lần 3 4387990 1269674 5657664 40,08 49,23 0,49 Trung 39,75 48,82 0,49 bình %RSD 1,29 1,29 1,29 Trung 0,55 bình %RSD 15,41
Từ kết quả trên cho thấy, %RSD của 2 mẫu lớn cao 15,41% vượt so với yêu cầu là 7,3%. Từ đó cho thấy khả năng ứng dụng điều kiện xà phịng hố trong nghiên cứu này.
3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn
Kết quả đo được thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phịng hố mẫu thêm chuẩn Mẫu Lần Strans- Scis- Stổng CLutein tìm thấy CLutein tổng mLutein
(ppm) ppm (g) 1 1 9344453 3041293 12385746 86,53 106,27 1,06 2 7852670 2433703 10286373 72,03 88,47 0,88 3 8604178 3540186 12144364 84,86 104,23 1,04 TB 81,14 99,66 1,00 %RSD 9,77 9,77 9,77 2 1 9153751 3257149 12410900 86,70 106,49 1,06 2 8230904 2869124 11100028 77,65 95,37 0,95 3 10981777 3783456 14765233 102,95 126,45 1,26 TB 89,10 109,43 1,09 %RSD 14,39 14,39 14,39 TB(1+2) TB(1+2) 1,05 %RSD 6,61
Từ kết quả bảng 3.17 và 3.18, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của q trình xà phịng hố như sau:
%Rxà phịng hố = (mlutein (mẫu thêm chuẩn) – mlutein (mẫu lớn)) *100/mlutein
(đã thêm vào) = (1,05 – 0,55)*100/0,6 = 83,3%
Vậy hiệu suất thu hồi của q trình xà phịng hố trong nghiên cứu trên là 83,3%. Kết quả này là đạt yêu cầu so với quy định (80% – 110%).
Từ kết quả tính hiệu suất thu hồi của q trình xà phịng hố, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của tồn bộ q trình phân tích, bao gồm q trình xà phịng hố và q trình phân tích trên HPLC, cụ thể như sau:
%Rquá trình = (%Rxà phịng hố * %RHPLC) * 100/1 = (81,52/100 * 83,3/100)*100/1 = 67,9%
Với kết quả hiệu suất thu hồi của tồn bộ q trình phân tích trên, ta hồn tồn có thể ứng dụng phương pháp nghiên cứu này vào việc phân tích lutein hoặc các carotenoid khác.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được qua nghiên cứu trên có thể đi đến các kết luận sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp chứa lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. sử dụng cột pha ngược C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) như sau:
- Pha động: gồm hệ 2 dung môi
A= MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)
Rửa giải gradient theo chương trình như sau:
0 - 10 phút: 0% B (100% A) 10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (100% A về 0% A) (gradient tuyến tính) 25 - 60 phút: 100% B 60 – 70 phút: 100% B về 0% B 70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ cột 250C
-Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm 2. Phương pháp HPLC đã xây dựng có
-Tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein và lutein ester. - Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01%
- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ = 2,55ppm.
- Hiệu suất hồi đạt yêu cầu với %R trung bình 81,52%.
3. Dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC nói trên, đã xác định được điều kiện thích hợp để xà phịng hố lutein ester từ hoa cúc vạn thọ như