CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà
hợp xà phịng hóa lutein ester
2.3.3.1. Phương pháp tổng qt xà phịng hóa lutein ester
Cân chính xác G gam mẫu oleoresin (chứa hỗn hợp lutein ester thu nhận từ hoa cúc vạn thọ) cho vào bình cầu cổ nhám 50 ml. Thêm vào mẫu oloeoresin V ml dung dịch KOH trong EtOH 960 (ký hiệu nồng độ KOH là CKOH, g/ml). Lắp sinh hàn hồi lưu, đun nóng và khuấy đều hỗn hợp ở 700C trong 1 h (trong điều kiện tránh ánh sáng).
Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước cất vào hỗn hợp đến thể tích gấp đơi, lắc đều. Tiếp đó, chuyển hỗn hợp vào phễu chiết có chứa sẵn một thể tích tương đương ethyl acetate, khuấy đều, để yên cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn. Tách riêng pha nước bên dưới, đem chiết lặp lại như trên thêm 2 lần nữa. Pha ethyl acetate bên trên trong các lần chiết (chứa lutein tự do) được gộp lại, cho vào phễu chiết khác, rửa 3 lần bằng nước cất (thể tích tương đương với thể tích ethyl acetate) để loại bỏ các tạp chất tan trong nước. Lọc dịch chiết ethyl acetate qua một lớp Na2SO4 khan, cho vào bình định mức, định mức đến vạch bằng acetate ethyl. Bảo quản dịch chiết dung dịch ở - 200C cho đến khi phân tích.
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phịng hóa lutein ester
Dịch chiết lutein tự do trong ethyl acetate thu được sau quá trình xà phịng hóa (xem mục 2.3.3.1) được pha lỗng 100 lần bằng acetone HPLC rồi bơm vào thiết bị HPLC Chromaster của hãng HITACHI (Nhật Bản) đang nghiên cứu, trong đó điều kiện chạy HPLC dựa trên kết quả khảo sát “cải biến
phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp lutein ester” (xem mục 2.3.1)
Hiệu suất xà phịng hóa được tính theo cơng thức:
Hiệu suất xà phịng hóa (%) = SLutein*100/SLutein ester
Hiệu suất xà phịng hố trans-lutein (%) = Strans-lutein*100/Slutein ester
Hiệu suất xà phịng hố cis-lutein (%) = Scis-lutein*100/Slutein ester với:
SLutein: là diện tích peak lutein tự do (dạng trans và dạng cis) trên sắc ký đồ của mẫu sau khi xà phịng hóa (nhận biết peak lutein nhờ mẫu lutein đối chứng; phân biệt các peak trans- và cis-lutein dựa vào sự khác biệt về phổ hấp thụ UV-Vis của chúng trong ở vùng phổ 300 - 350 nm)
Strans-lutein: là diện tích peak của trans- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau
khi xà phịng hố.
Scis-lutein: là diện tích peak của cis- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau khi
xà phịng hố.
Slutein ester: là tổng diện tích tất cả các peak thu được trên sắc ký đồ khi phân tích mẫu oleoresin (tức lutein ester) có cùng nồng độ khơng xà phịng hóa nhưng cũng được chiết và phân tích trong điều kiện giống hệt mẫu đem xà phịng hóa.
2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phịng hóa lutein esterđến đến hiệu suất xà phịng đến đến hiệu suất xà phòng
a) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin
Tiến hành xà phịng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mơ tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ KOH là CKOH = 0,15 g/ml và thay đổi nồng độ oleoresin trong hỗn hợp phản ứng lần lượt là:
Coleoresin = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 0,9 (g/ml).
Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phịng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nồng độ oleoresin thích hợp cho phản ứng.
b) Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ KOH
Tiến hành xà phịng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mơ tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ oleoresin là 0,3 g/ml và thay đổi nồng độ KOH lần lượt là:
CKOH = 0,00; 0,025; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 (g/ml).
Sau khi phản ứng hồn tất, xác định hiệu suất xà phịng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn tỷ lệ KOH/oleoresin thích hợp cho phản ứng.
c) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phịng hóa
Cân chính xác các lượng oleoresin (khoảng 3 gam) cho vào 5 bình cầu cổ nhám 50 ml khác nhau. Thêm vào đó một thể tích chính xác của dung dịch KOH 5% w/v trong EtOH 960 (có 0,1% BHT) sao cho nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,3 g/ml. Tiến hành xà phịng hóa các mẫu (bằng cách đun cách thủy và khuấy đều trong 1 giờ), trong đó nhiệt độ phản ứng ở các mẫu khảo sát thay đổi: 40; 50; 60; 70; 800C.
Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phịng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nhiệt độ xà phịng hóa thích hợp.
d) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phịng hóa
Tiến hành xà phịng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mơ tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nhiệt độ xà phịng hóa (bằng nhiệt độ đã chọn từ kết quả thí nghiệm 2.3.3.1.c) nhưng thay đổi thời gian phản ứng lần lượt là:
20; 40; 60; 80; 100; 120; 180 phút.
Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phịng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn thời gian xà phịng hóa thích hợp.
2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phịng hóa lutein ester
a) Xà phịng hố lutein ester lượng lớn
oleoresin và nồng độ KOH ứng với giá trị thích hợp được xác định từ các thí nghiệm 2.3.3.3a và b. Lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều, đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ và thời gian được xác định từ kết quả các thí nghiệm 2.3.3.3 c và 2.3.3.3d. Hỗn hợp sau khi xà phịng hóa được chiết bằng ethyl acetate, rửa bằng nước cất (3 lần), lọc qua Na2SO4 khan rồi định mức bằng acetone thành 100 ml. Hút dịch chiết ethyl acetate rồi pha loãng 100 lần bằng acetone HPLC, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC.
b) Xà phịng hố lutein ester thêm chuẩn
Tiến hành tương tự như mục 2.3.3.4a nhưng thêm vào đó 0,6g lutein chuẩn.
Sau khi tiến hành xà phịng hố và chạy HPLC, tính được hiệu suất thu hồi lutein và độ thu hồi %R của q trình xà phịng hố theo công thức:
H%=C
%Rxà phịng hố = (Lượng lutein trong mẫu thêm tìm thấy (mthêm tìm thấy) – Lượng lutein trong mẫu không thêm (mkhông thêm))*100/ Lượng lutein đã thêm
(mthêm)
Từ đó tính được hiệu suất thu hồi lutein của tồn bộ q trình phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi của q trình xà phịng hố và hiệu suất thu hồi được phân tích trên thiết bị HPLC)
%Rtồn bộ = %Rxà phịng hố * %Rphân tích
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Phân tích ANOVA với độ tin cậy P = 0,95 để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER
3.1.1. Chọn thành phần pha động
Kết quả thử nghiệm 6 chế độ rửa giải isocratic được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ
lutein và lutein ester
Ký Thành phần pha động Thời gian Thừa số
MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O Peak lưu lưu giữ
hiệu (v/v/v/v) (tR) (k’) I1 70:15:10:5 Lu 9,293 1,966 LuE KRG - I2 45:40:10:5 Lu 8,873 1,862 LuE KRG - I3 70:9:20:1 Lu 5,493 0,772 LuE KRG - I4 50:9:40:1 Lu - << 1 LuE 14,233 – 38,220 4,348 –11,329 I5 45:12:42:1 Lu - << 1 LuE 13,540 – 28,680 3,368 – 8,252 I6 45:14:40:1 Lu - << 1 LuE 12,039 – 24,433 2,591 – 5,757
Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của
Từ bảng 3.1. cho thấy:
Nhìn chung, khi thay đổi từ chế độ rửa giải isocratic từ I1 đến I6 (ứng với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 10% đến 40%) thì các carotenoid đều được rửa giải nhanh hơn, tức thừa số lưu giữ của lutein tự do và lutein ester đều giảm xuống. Nguyên nhân là do CH2Cl2 có khả năng hịa tan rất tốt các carotenoid, do đó tỷ lệ CH2Cl2 càng lớn sẽ càng thuận lợi cho sự rửa giải lutein và lutein ester ra khỏi pha tĩnh. Với tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động là 10% thì thừa số lưu giữ của lutein là k’lutein » 2 (từ 1,862 – 1,998), tức thỏa mãn yêu cầu trong sắc ký (k’ = 2 – 5). Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động lên 20% thì thừa số lưu giữ k’lutein = 0,772 <1. Ngược lại, khi tỷ lệ CH2Cl2 khơng q 20% thì lutein ester khơng rửa giải được (khơng thấy xuất hiện sau 120 phút). Khi tăng tỷ lệ CH2Cl2 lên 40% thì nhóm hợp chất này mới được rửa giải nhưng khi đó lutein lại rửa giải quá sớm (k’lutein<<1). Nghịch lý trên cho thấy không thể sử dụng chế độ rửa giải isocratic để phân tích hỗn hợp chứa đồng thời lutein và lutein ester mà cần phải dùng chế độ rửa giải gradient.
Dựa vào việc phân tích các kết quả trên chúng tôi đề xuất sử dụng hệ 2 pha động:
A= MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)
với chế độ rửa giải như sau:
0 – 10 phút: 0% B 10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (gradient tuyến tính) 25 – 60 phút: 100% B 60 – 70 phút: 100% B về 0% B 70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột) Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Nhiệt độ cột: 250C
%
100 A B
O 10 25 60 70 75 t
Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải
Áp dụng chế độ rửa giải nói trên cho hỗn hợp lutein và lutein ester chúng tôi ghi nhận được sắc ký đồ HPLC (Hình 3.3). Các thơng số mơ tả thời gian lưu (tR) và thừa số lưu giữ (k’) của các cấu tử trong mẫu được cho trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa
giải theo chương trình gradient dung mơi đề nghị.
STT Cấu tử Thời gian lưu Thừa số lưu giữ
tR (phút) k’= (tR – t0)/t0
1 Dung môi (acetone) 3,100 0
2 Lutein tự do 8,847 1,854 3 Lutein ester-1 37,887 11,222 4 Lutein ester-2 40,433 12,043 5 Lutein ester-3 43,407 13,002 6 Lutein ester-4 46,940 14,142 7 Lutein ester-5 51,167 15,505
Với chương trình rửa giải gradient đã thử nghiệm thì các giá trị thừa số lưu giữ của các cấu tử trong mẫu rơi vào khoảng 1,854 – 15,505. Với hỗn hợp mẫu phức tạp gồm nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau nhiều (từ lutein tự do khá phân cực đến lutein ester kém phân cực) thì có thể chọn chế độ rửa giải sao cho k’ = 1 – 20. Do đó, chương trình rửa giải gradient nói trên được chúng tơi áp dụng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2. Chọn tốc độ dòng
Khi thay đổi tốc độ dòng lần lượt từ 0,8 đến 1,0 và 1,2 ml/phút thì các sắc ký đồ thu được đều cho các peak rõ đẹp, tách nhau hoàn toàn. Để chọn tốc độ dịng thích hợp, cần đánh giá ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu (tR), thừa số lưu giữ (k’), độ rộng peak (W) và số đĩa lý thuyết (N) đối với các cấu tử trong hỗn hợp lutein và các lutein ester (xem bảng 3.3 và các đồ thị 3.4.a, 3.4.b và 3.4.c).
Theo đó, khi tăng tốc độ dịng từ 0,8 lên 1,2 ml/phút thì:
-Thừa số lưu giữ (k’) của lutein gần như không đổi (» 1,85) nhưng của các lutein ester tăng lên gần như tuyến tính. Nguyên nhân là do khi tốc độ pha động tăng thì thời gian chết t0 giảm.
- Độ rộng chân peak (W) giảm đáng kể khi tốc độ dịng tăng từ 0,8-1,0 ml/phút nhưng sau đó giảm rất ít hay gần như khơng đổi (trên sắc ký đồ quan sát thấy các peak trở nên thon, nhọn hơn)
- Số đĩa lý thuyết của các cấu tử (N) tăng khi tốc độ dòng tăng từ 0,8 - 1,0 ml/phút nhưng sau đó lại giảm hoặc gần như khơng đổi khi tốc độ dịng tăng từ 1,0 đến 1,2 ml/phút.
Do vậy, để thu được sắc ký đồ với các peak thon gọn, hiệu quả tách của cột tốt hơn, thời gian phân tích khơng dài, tốc độ dịng u = 1,0 ml/phút được chọn để tiếp tục khảo sát.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý
thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích.
u Đại Cấu tử phân tích
(ml/ lượng sắc Dung Lu LuE- LuE- LuE- LuE- LuE-
phút) ký môi 1 2 3 4 5 tR (phút) 3,90 11,09 41,52 44,45 47,95 51,99 56,87 0,8 k’ 0 1,84 9,65 10,40 11,30 12,33 13,58 W (phút) 1,15 0,95 1,53 1,66 2,04 2,46 N (đĩa) 626 25091 11240 11268 8890 7419 tR (phút) 3,10 8,85 37,89 40,43 43,41 46,94 51,17 1,0 k’ 0 1,85 11,22 12,04 13,00 14,14 15,51 W (phút) 0,82 0,77 1,21 1,41 1,83 2,00 N (đĩa) 768 32657 15231 13075 9182 9242 tR (phút) 2,58 7,35 35,53 37,84 40,55 43,79 47,65 1,2 k’ 0 1,85 12,77 13,67 14,72 15,97 17,47 W (phút) 0,77 0,93 1,26 1,35 1,78 1,89 N (đĩa) 615 20081 12530 12655 8575 9100
20 18 16 14 Lu k' 12 LuE-1 10 Lu-2 8 LuE-3 6 LuE-4 4 2 LuE-5 0 0,6 0,8 1 1,2 1,4 u (mL/phút)
a) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thừa số lưu giữ của lutein và lutein ester
3,00 Lu 2,50 LuE-1 Lu-2 (m in ) 2,001,50 LuE-3LuE-4 LuE-5 W 1,00 0,50 0,00 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 u (mL/phút)
b) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến độ rộng chân peak của lutein và lutein ester 35000 Lu 30000 LuE-1 25000 LuE-2 LuE-3 N ( đĩ a) 20000 LuE-4 LuE-5 15000 10000 5000 0 0,6 0,8 1 1,2 1,4 u (mL/phút)
c) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến số đĩa lý thuyết của lutein và lutein ester
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dịng từ
3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu
Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu (Vinj) đến đặc tính sắc ký của các cấu tử được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.6
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak,
số đĩa lý thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích.
Vinj Đại lượng
(µl) sắc ký tR (phút) k’ S 5 W N (đĩa) H (mm/đĩa) tR (phút) k’ S 10 W N (đĩa) H (mm/đĩa) tR (phút) k’ S W 15 N (đĩa) H (mm/đĩa) tR (phút) k’ S W 20 N (đĩa) H (mm/đĩa) Cấu tử phân tích
Lu LuE-1 LuE-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5
8,84 38,00 40,30 43,50 47,07 51,41 1,85 11,26 12,00 13,03 14,18 15,58 954584 610084 42156 795051 1005848 489592 0,70 1,66 0,87 1,39 1,29 1,62 1076 7072 29253 13516 18591 14230 0,232 0,035 0,009 0,018 0,013 0,018 8,88 37,94 40,49 43,51 47,07 51,37 1,86 11,24 12,06 13,04 14,18 15,57 1245693 103020 434141 1181692 2775514 964367 0,9 0,64 0,95 1,27 1,72 1,66 660 47415 24789 16201 10455 13527 0,379 0,005 0,010 0,015 0,024 0,018 8,86 37,92 40,48 43,48 47,047 51,313 1,85 11,23 12,06 13,03 14,178 15,55 2126024 197624 638967 1713045 4219258 1544386 0,95 0,830 1,08 1,35 1,97 1,79 588,19 28159,2 19166,8 14314,79 7962,44 11607,6 7 6 0,425 0,009 0,013 0,017 0,031 0,022 8,847 37,887 40,433 43,407 46,94 51,167 1,85 11,22 12,04 13,01 14,14 15,50 3391830 345782 974498 2462189 5660473 2104321 1,02 0,77 1,21 1,41 1,83 2 507,93 32656,7 15231,2 13075,03 9182,46 9241,75 0,49 0,01 0,012 0,02 0,027 0,027
5000000 S 40000003000000 LuE-1LuE-2 2000000 LuE-3 1000000 LuE-4 0 5 10 (µl) 15 20 LuE-5 v
a) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak của lutein và lutein ester
50000 Lu LuE-1 LuE-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5
45000 đ ĩa ) 40000 35000 30000 (N , 25000 th u yế t 20000 15000 10000 lý 5000 S ố đ
ĩa 0 5 10 V-inject (uL)15 20
b) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến số đĩa lý thuyết của lutein và lutein ester
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến q trình sắc ký
Qua khảo sát các thể tích bơm mẫu khác nhau từ 5µl; 10µl; 15µl; 20µl thì hầu như các peak lutein và lutein ester đều rửa giải với thời gian lưu và hệ số lưu giữ gần như là như nhau. Tuy nhiên, để lựa chọn thể tích bơm mẫu phù hợp, chúng ta cần xét đến ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak và số đĩa lý thuyết cũng như chiều cao đĩa, cụ thể như sau:
-Khi thể tích bơm mẫu tăng thì chiều cao và diện tích peak của các lutein và lutein ester tăng đáng kể. Điều này cho thấy độ nhạy của phương pháp tăng khi tăng thể tích bơm mẫu.