chất A và B [38]
1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết (ký hiệu: N) là đại lượng biểu thị hiệu năng tách của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Theo lý thuyết đĩa, cột sắc ký có thể xem gồm nhiều đĩa lý thuyết có chiều cao là H, tại mỗi đĩa ứng một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động:
H=NL
(L: chiều dài của pha tĩnh nhồi trong cột sắc ký) Đối với peak có dạng phân bố chuẩn Gauss thì:
ỉ tr ư2
N = 5,54ỗ ÷
èỗW1/ 2 ø÷
trong đó: W1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao của peak Theo Van Deemter:
2gD é d 2 f f (d 2, d 2 ) ù H = 2ld P + M + êk. + P C úu DS DM u ê ú ë û trong đó: dP: kích thước hạt pha tĩnh
df: độ dày lớp phủ lỏng trên pha tĩnh dC: đường kính cột
λ: thơng số phụ thuộc kích thước hạt và độ đồng nhất của pha tĩnh g: thông số phụ thuộc khoảng cách giữa các hạt
k: hằng số đặc trưng cho quá trình chuyển khối DM: hệ số khuếch tán trong pha động
DS: hệ số khuếch tán của cấu tử phân tích trong pha tĩnh
u : tốc độ trung bình của pha động
Như vậy, H phụ thuộc vào đường kính và khả năng hấp phụ của hạt pha tĩnh, tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động; hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
1.2.3.5. Độ phân giải
Độ phân giải (ký hiệu: R) là đại lượng biểu thị độ tách của các peak A, B ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho [39].
2(tr ,B - tr , A ) 1 ỉa -1 ưỉ k ' ư R = = N ỗ ữỗ ÷ WB +WA 4 è a ỗ +k '÷ ø 1 ø è
trong đó: k ' là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh nhau cần phân tách.
Trong thực tế, nếu các peak đối xứng thì để định tính (hai peak tách nhau) thì độ phân giải tối thiểu là R = 1,0; còn để định lượng R = 1,5 là phù hợp.
Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính tốn diện tích peak sẽ khơng chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:
• Tăng thừa số dung lượng k ' bằng cách giảm lực rửa giải của pha động (giảm nhiệt độ cột, thay đổi thành phần pha động, thay đổi pha tĩnh sao cho tăng khả năng lưu giữ chất)
• Tăng số đĩa lý thuyết N của cột bằng cách dùng cột dài hơn
• Giảm chiều cao đĩa lý thuyết H bằng cách điều chỉnh tốc độ pha động để H cực tiểu; dùng cột có kích thước hạt pha tĩnh nhỏ hơn hoặc cột có đường kính nhỏ hơn
• Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác có pha tĩnh tương tác chọn lọc hơn với các cấu tử cần tách.
Tuy nhiên, nếu R q lớn thì thời gian phân tích sẽ dài, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung mơi. Tuy nhiên, nếu dùng gradient dung mơi thì trong q trình chạy sắc ký sự thay đổi thành phần pha động sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích các peak phân tích. Do vậy, nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung mơi [39].
1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC
Để xây dựng một quy trình phân tích HPLC cần xác lập các điều kiện sắc ký sao cho tối ưu hóa độ phân giải đối với các chất cần phân tích trong một thời gian ngắn nhất có thể được. Muốn vậy, cần thực hiện các bước khảo sát sau:
1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký
Tùy thuộc vào loại và tính chất chất phân tích (độ tan, phân tử lượng), nền mẫu và điều kiện phịng thí nghiệm (có sẵn loại cột sắc ký gì) mà chọn kiểu sắc ký phù hợp.
- Chất phân tích có phân tử lượng <2000:
*Chất phân tích tan tốt trong nước: nếu là hợp chất ion thì dùng sắc ký trao đổi ion hay sắc ký cặp ion; nếu là hợp chất phân cực và khơng điện ly thì dùng sắc ký pha đảo.
* Chất phân tích tan tốt trong dung mơi hữu cơ kém phân cực (như hexan) thì dùng sắc ký pha thường; nếu tan trong dung mơi hữu cơ phân cực trung bình (như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran…) thì dùng sắc ký pha đảo.
- Chất phân tích có phân tử lượng >2000: nếu tan tốt trong nước thì dùng sắc ký lọc gel theo cơ chế trao đổi ion; nếu tan tốt trong dung môi hữu cơ thì dùng sắc ký thấm qua gel [40].
1.2.4.2. Chọn cột sắc ký
a) Chọn pha tĩnh: dựa vào thành phần và tính chất của các cấu tử có trong mẫu phân tích để lựa chọn. Pha tĩnh cần có tương tác vừa phải và chọn lọc hỗn hợp chất cần phân tích.
- Để tách các chất khơng phân cực hay ít phân cực: dùng cột pha
thường (NP: normal phase) tức cột có pha tĩnh phân cực (ví dụ: cột silica trung tính có chứa các nhóm –OH phân cực trên bề mặt; cột silica được ghép dây nhánh chứa nhóm chức phân cực như cyanopropyl, aminopropyl, diol...)
- Để tách các chất khơng phân cực, ít phân cực hay các chất phân cực
có thể tạo cặp ion: dùng cột pha đảo (RP: reversed phase) tức là cột kém phân
cực, trong đó pha tĩnh là silica được ghép dây nhánh Ankyl mạch hở (C3; C8; C18; C30) hay alkyl chứa vịng thơm (cột phenyl). Trong số đó, cột C18 được sử dụng nhiều nhất do nó có khả năng tách hiệu quả những nhóm hợp chất có
phân tử lượng nhỏ từ khơng phân cực, phân cực trung bình và cả những hợp chất ion.
b) Chọn kích thước cột và cỡ hạt pha tĩnh:
Nếu muốn phân tích nhanh và hiệu quả tách tốt thì dùng cột ngắn và có kích thước hạt nhỏ (<2 µm).
Nếu cần phân tích hỗn hợp phức tạp nhiều cấu tử thì dùng cột dài hơn.
1.2.4.3. Chọn pha động
Để luận chọn pha động phù hợp cần thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Hòa tan được hỗn hợp chất phân tích để có thể rửa giải được chúng. - Trơ với pha tĩnh, tức không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học.
- Bền theo thời gian, ít nhất trong suốt thời gian phân tích mẫu.
- Có độ tinh khiết cao (dung mơi cho HPLC, hóa chất tinh khiết phân tích)
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phải khơng cho tín hiệu với loại detector sử dụng. Ví dụ: Dùng detector UV/Vis thì dung mơi khơng được hấp thụ trong vùng bước sóng phân tích; dùng detector huỳnh quang thì dung mơi khơng được phát quang...
- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Thơng thường, pha động thường có độ phân cực ngược với pha tĩnh: - Với hệ sắc ký pha đảo (RP – HPLC) pha động thường có là tổ hợp một số dung mơi phân cực (ví dụ: nước- methanol, nước- acetonitrile...). Ngồi ra, có thể bổ sung một số dung môi phân cực trung bình (tetrahydrofuran, dichloromethane, isopropanol...), hoặc thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH, thêm chất tạo phức, tạo cặp ion... để tạo ra sự rửa giải tốt nhất
- Với hệ sắc ký pha thường (NP-HPLC) thì dùng pha động kém phân cực (ví dụ: hexan; hỗn hợp hexan – ethyl acetate...) [39].
1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải
Để chọn chế độ rửa giải phù hợp, cần thử nghiệm nhiều lần để chọn thành phần pha động (chứa tổ hợp các dung môi nào), tốc độ dòng, nhiệt độ cột... để đạt độ phân giải tốt và peak có độ nhạy cao.
Ngồi ra, cần chọn chế độ rửa giải sao cho hiệu quả tách tốt nhưng với thời gian ngắn nhất.
- Nếu hỗn hợp phân tích gồm các cấu tử có độ phân cực khơng khác nhau nhiều thì nên rửa giải isocratic.
- Nếu hỗn hợp phân tích chứa các cấu tử có độ phân cực khác nhau nhiều (ví dụ: gồm hợp chất phân cực trung bình và kém phân cực) thì phải rửa giải gradient.
Việc xây dựng quy trình phân tích HPLC là cơng việc hết sức cần thiết, tuy nhiên, để có một quy trình phân tích tốt địi hỏi mất nhiều thời gian khảo sát [39]. Trong thực tế, chúng ta thường áp dụng một số quy trình phân tích của một nhóm hợp chất nào đó đã được phát triển bởi các chun gia phân tích. Thế nhưng, việc áp dụng những quy trình này có thể cho kết quả khơng mong muốn. Do đó, để đỡ mất thời gian xây dựng một quy trình phân tích mới, chúng ta có thể cải biến (modification) quy trình có sẵn sao cho đạt hiệu quả mong muốn. Tuy vây, các quy trình này đều cần được thẩm định trước khi áp dụng trên đối tượng phân tích.
1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương phápHPLC HPLC
Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng khơng. Theo các hướng dẫn của ICH 1994 và 1996 [Q2A: Thẩm định phương pháp phân tích: Định nghĩa và thuật ngữ, ngày 27 tháng 10 năm 1994”; “Q2B: Thẩm định quy trình phân tích: Phương pháp luận, ngày 6 tháng 11 năm 1996”] để thẩm định một quy trình phân tích định lượng bằng phương pháp HPLC cần tiến hành đánh giá những tiêu chí tiêu sau:
1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy tối thiểu.
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu tự tạo hay mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm).
Yêu cầu cần đạt: Độ phân giải giữa peak liền kề với peak của chất cần phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (nếu RSD >2% phải có sự giải thích phù hợp) [41].
1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity)
Là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Trong phân tích định lượng, tính đặc hiệu đánh giá khả năng đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử.
- Cách khảo sát:
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau: (1) mẫu trắng (dung môi pha động/dung mơi hịa tan mẫu); (2) mẫu nền (mẫu khơng có chất cần phân tích); (3) mẫu chuẩn; (4) mẫu tự tạo (mẫu khơng có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và (5) mẫu thử chứa chất cần phân tích được chuẩn bị theo quy trình.
Yêu cầu cần đạt:
- Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo cho peak của chất cần phân tích phải tách hồn tồn khỏi các peak khác (nếu có trong nền mẫu).
- Sắc ký đồ của mẫu trắng hay dung dịch nền mẫu không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0% so với đáp ứng peak của mẫu chuẩn.
- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết, nghĩa là hệ số chồng phổ UV-Vis của peak hoạt chất cần phân tích thu
được trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử/mẫu tự tạo với peak tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99 [41].
1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy)
Là biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực (hoặc giá trị trung bình) với giá trị đúng (hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận).
Cách khảo sát:
-Cách 1 (tiến hành trên mẫu tự tạo): Chuẩn bị 03 mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu
khơng có chất cần phân tích (Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn
thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ phân tích). Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính.
- Cách 2 (thực hiện trên mẫu phân tích) : Chuẩn bị 06 mẫu thử độc lập với lượng chất chuẩn thêm vào ứng với mức nồng độ 100% của chất cần phân tích.
Tính độ thu hồi (% Recovery) theo công thức:
Độ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/Lượng chất chuẩn thêm vào
Yêu cầu đối với phép thử định lượng: Độ thu hồi (%) = 98,0 - 102,0% [40]
1.2.5.4. Độ chính xác (Precision)
Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mơ tả.
Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD: standard deviation) hoặc hệ số dao động (RSD: relative standard deviation) của một loạt phép đo.
n å( X i - X n ) 2 SD = i=1 n -1 %RSD = Sn .100% X n trong đó:
Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất (nếu khơng có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu thử).
Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp.
a) Độ lặp lại (Repeatability): diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.
Cách khảo sát: Định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày.
b) Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phịng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, bởi các kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.
Cách khảo sát: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm nghiệm viên/khác hệ thống HPLC.
Theo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân tích ở nồng độ nhỏ (<100 ppm) là giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n = 6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên/khác ngày (n = 12) phải ≤ 5,0%.
c) Độ tái lặp (Reproducibility): diễn tả độ chính xác giữa các phịng thí nghiệm phối hợp nhau để tiêu chuẩn hoá phương pháp [40].
1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)
Là khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử trong đó quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính.
Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký 5 - 8 dung dịch chuẩn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng peak thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Yêu cầu cần đạt: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). (Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp)
1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit)
Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà một q trình phân tích có thể phân biệt một cách đáng tin cậy với nhiễu nền.
LOD thường được xác định bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak có diện tích gấp 3 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.
Giới hạn định lượng (LOQ: Quantitation Limit): là nồng độ nhỏ nhất
của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ thường được tính bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak có diện tích gấp 10 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng [41].
LOD và LOQ có thể xác định theo 1 trong 2 cách:
- Cách 1: Pha lỗng dung dịch chuẩn đến lúc diện tích peak của chất phân tích gấp 3 lần (nếu tính LOD) hay gấp 10 lần (đối với LOQ) độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.
- Cách 2: Dựa vào đường chuẩn tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng.
LOD = (3,3 x s)/a; LOQ = 3,3 x LOD trong đó:
s: độ lệch chuẩn của tín hiệu ứng với mẫu nền .
a: hệ góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng (thường là diện tích peak) của chất cần phân tích [40].
1.2.5.7. Độ thơ (Robustness)
Đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích khơng bị ảnh hưởng bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thơng số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của quy trình trong điều kiện sử dụng bình thường.
1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope)
Cho biết quy trình phân tích đã cho có thể áp dụng được trên các loại nền mẫu nào.
Như vậy, việc xây dựng một quy trình HPLC đã khó khăn thì việc tiến hành thẩm định quy trình càng phức tạp do rất tốn kém. Do vậy, trong thực tế chỉ có thể đánh giá trên một số tiêu chí thực tiễn nào đó sao cho có sự cân đối giữa yêu cầu về tính chính xác, tính khoa học của phương pháp với phí tổn, thời gian và việc huấn luyện đội ngũ các nhà phân tích.