CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hoá thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.18.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa. Nhiệt độ Hiệu suất thu Hiệu suất thu Hiệu suất xà phòng
(0C) nhận trans-lutein nhận hóa (%) cis-lutein (%) tổng cộng (%) 40 2,24 0,00 2,24 50 6,51 0,00 6,51 60 8,60 0,00 8,60 70 56,90 9,22 66,12 80 59,25 15,39 74,64 100 Trans-Lutein Cis-Lutein Tổng Lutein (% ) 80 74,64 66,12 60 59,25 xà phò ng 56,90 40 H iệ u su ất 20 15,39 6,51 8,60 9,22 2,24 6,51 8,60 0 2,24 0,00 0,00 0,00 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (độ C)
Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester và chất lượng sản phẩm lutein tự do hình thành.
- Ở nhiệt độ 400C hiệu suất xà phòng hóa rất thấp (chỉ khoảng 2,24%) tại đó lượng lutein ester còn lại rất lớn trong khi đó lượng lutein tự do hình thành không đáng kể. Điều đó thể hiện rõ ở sắc ký đồ hình 3.19.a). Thực nghiệm cho thấy ở 400C oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ là một khối lỏng đặc sệt, rất khó khuấy trộn. Khi được gia nhiệt, oleoresin dần dần chảy lỏng ra, dễ khuấy hơn.
- Khi tăng nhiệt độ từ 40 – 600C thì hiệu suất xà phòng hóa tăng lên nhưng chậm (từ 2,24% – 8,60%). Nếu tiếp tục tang nhiệt độ từ 60-700C thì hiệu suất phản ứng tăng rất mạnh (từ 8,6% – 66,12%) nhưng sau đó lại tăng chậm dần. Như vậy, khi tăng nhiệt độ xà phòng hoá thì hiệu suất tăng có thể được giải thích bởi sự gia tăng khả năng tiếp xúc các tác chất (oleoresin và KOH) với nhau, nhờ đó tốc độ phản ứng tăng lên.
Các sắc ký đồ HPLC (Hình 3.19) cũng cho thấy ở nhiệt độ dưới 600C thì sản phẩm lutein tự do hình thành chỉ có đồng phân trans chứ không có đồng phân cis. Tuy nhiên, trên 600C thì đồng phân cis xuất hiện và tỷ lệ đồng phân cis/trans càng tăng khi nhiệt độ càng tăng. Do vậy, mặc dù hiệu suất xà phòng hóa ở 800C cao hơn ở 700C nhưng ở 800C tỷ lệ đồng phân cis trong hỗn hợp sản phẩm lutein tự do (khoảng 20%) cao hơn đáng kể so với tỷ lệ này ở 700C (khoảng 13,9%). Do vậy, để hiệu suất xà phòng hóa cao đồng thời bảo đảm hoạt tính sinh học của sản phẩm tương đối tốt, nên tiến hành xà phòng hóa ở 700C. Kết luận này cũng phù hợp với điều kiện về nhiệt độ xà phòng hóa lutein ester đã được đề nghị bởi Swaminathan (2009).
a) Ở 400C
b) Ở 500C
d) Ở 700C
e) Ở 800C
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau.
hóa
Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hoá khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml; nồng độ KOH là 15% w/v; nhiệt độ 700C được thể hiện ở Bảng 3.12 và Hình 3.20.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.
Thờigian Hiệu suất thu nhận Hiệu suất thu nhận Hiệu suất xà phòng hóa (min) trans-lutein (%) cis-lutein (%) tổng cộng (%)
0 0,00 0,00 0,00 20 54,98 11,10 66,07 40 57,70 10,55 68,25 60 61,54 13,20 74,74 80 67,65 14,30 81,95 100 57,93 14,08 72,01 120 55,12 15,56 70,68 180 41,70 10,60 52,29 100 Trans-Lutein Cis-Lutein Tổng-Lutein 80 l u t 60 th u nh ậ n 40 H iệ u su ất 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Thời gian (phút)
Từ kết quả khảo sát trên, cho thấy:
- Trong thời gian 20 phút đầu tiên hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do ở các dạng đồng phân trans, cis và tổng số đều tăng rất mạnh (từ 0% lên đến 66,07%). Các sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin ban đầu và sau khi xà phòng hóa (Hình 3.21a và Hình3.21b) cũng cho thấy chỉ sau 20 phút các peak lutein ester hầu như biến mất; ngược lại xuất hiện các peak
trans-lutein (RT ~ 9,3 phút) và cis-lutein (RT ~ 10,9 phút).
- Tiếp tục đun nóng từ 20 - 80 phút thì hiệu suất thu nhận lutein tự do dạng trans và lutein tổng số tăng lên nhưng với tốc độ chậm hơn và sau đó lại giảm đi nếu kéo dài thời gian phản ứng. Trong khi đó, hiệu suất hình thành dạng cis-lutein hầu như không thay đổi khi thời gian phản ứng tăng từ 20 – 180 phút. Điều này chứng tỏ ở 700C đồng phân cis-lutein tương đối bền, còn đồng phân trans kém bền hơn. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất thu nhận lutein dạng trans- nếu kéo dài thời gian xà phòng hoá (trên 80 phút) là do sự chuyển hoá dạng đồng phân này sang dạng đồng phân cis- của lutein hoặc các dạng sản phẩm phân huỷ khác.
Theo kết quả nghiên cứu trên cho thấy thời gian thích hợp nhất để xà phòng hóa lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ ở 700C là 80 phút. Thời gian phản ứng này so với thời gian đề nghị bởi Swaminathan (2009) dài hơn 50 phút. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do trong quy trình của Swaminathan phản ứng xà phòng hóa được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn (từ 70-800C). Như đã nhận xét ở phần 3.5.3, việc tăng nhiệt độ phản ứng từ 70- 800C tuy có tác dụng làm tăng hiệu suất xà phòng hóa (nhờ vậy rút ngắn thời gian phản ứng) nhưng sẽ làm tăng tỷ lệ đồng phân cis- trong sản phẩm phản ứng, do đó làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm lutein thu nhận được. Do vậy, chúng tôi vẫn chọn nhiệt độ xà phòng hóa là 700C, ứng với thời gian xà phòng hóa 80 phút.
a) Mẫu chưa xà phòng hóa
b) Mẫu xà phòng hóa 20 phút
d) Mẫu xà phòng hoá 60 phút
e) Mẫu xà phòng hoá 80 phút
f) Mẫu xà phòng hoá 100 phút
g) Mẫu xà phòng hoá 120 phút
h) Mẫu xà phòng hoá 180 phút
Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời
3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá
Qua kết quả khảo sát điều kiện xà phòng hoá trên để đạt để hiệu suất xà phòng hoá cao, có thể rút ra một số kết luận sau:
-Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4% w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.
- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C - Thời gian xà phòng hoá là 80 phút
3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ
3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn
Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá cao chiết lutein ester trên mẫu lớn được thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn. Mẫu đo Strans- Scis- Stổng CLutein tìm CLutein tổng
mLutein (g) thấy(ppm) (ppm) Mẫu 1 Lần 1 4695346 2202866 6898212 48,64 59,75 0,60 Lần 2 4604332 2005289 6609621 46,65 57,30 0,57 Lần 3 5351572 2196035 7547607 53,13 65,25 0,65 TB 49,47 60,77 0,61 %RSD 6,70 6,70 6,70 Mẫu 2 Lần 1 3915929 1608596 5524525 39,16 48,10 0,48 Lần 2 4131982 1515102 5647084 40,01 49,14 0,49 Lần 3 4387990 1269674 5657664 40,08 49,23 0,49 Trung 39,75 48,82 0,49 bình %RSD 1,29 1,29 1,29 Trung 0,55 bình %RSD 15,41
Từ kết quả trên cho thấy, %RSD của 2 mẫu lớn cao 15,41% vượt so với yêu cầu là 7,3%. Từ đó cho thấy khả năng ứng dụng điều kiện xà phòng hoá trong nghiên cứu này.
3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn
Kết quả đo được thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn Mẫu Lần Strans- Scis- Stổng CLutein tìm thấy CLutein tổng mLutein
(ppm) ppm (g) 1 1 9344453 3041293 12385746 86,53 106,27 1,06 2 7852670 2433703 10286373 72,03 88,47 0,88 3 8604178 3540186 12144364 84,86 104,23 1,04 TB 81,14 99,66 1,00 %RSD 9,77 9,77 9,77 2 1 9153751 3257149 12410900 86,70 106,49 1,06 2 8230904 2869124 11100028 77,65 95,37 0,95 3 10981777 3783456 14765233 102,95 126,45 1,26 TB 89,10 109,43 1,09 %RSD 14,39 14,39 14,39 TB(1+2) TB(1+2) 1,05 %RSD 6,61
Từ kết quả bảng 3.17 và 3.18, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá như sau:
%Rxà phòng hoá = (mlutein (mẫu thêm chuẩn) – mlutein (mẫu lớn)) *100/mlutein (đã thêm vào) = (1,05 – 0,55)*100/0,6 = 83,3%
Vậy hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá trong nghiên cứu trên là 83,3%. Kết quả này là đạt yêu cầu so với quy định (80% – 110%).
Từ kết quả tính hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích, bao gồm quá trình xà phòng hoá và quá trình phân tích trên HPLC, cụ thể như sau:
%Rquá trình = (%Rxà phòng hoá * %RHPLC) * 100/1 = (81,52/100 * 83,3/100)*100/1 = 67,9%
Với kết quả hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích trên, ta hoàn toàn có thể ứng dụng phương pháp nghiên cứu này vào việc phân tích lutein hoặc các carotenoid khác.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được qua nghiên cứu trên có thể đi đến các kết luận sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp chứa lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. sử dụng cột pha ngược C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) như sau:
- Pha động: gồm hệ 2 dung môi
A= MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)
Rửa giải gradient theo chương trình như sau:
0 - 10 phút: 0% B (100% A) 10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (100% A về 0% A) (gradient tuyến tính) 25 - 60 phút: 100% B 60 – 70 phút: 100% B về 0% B 70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích bơm mẫu: 20 µl - Nhiệt độ cột 250C
-Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm 2. Phương pháp HPLC đã xây dựng có
-Tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein và lutein ester. - Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01%
- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ = 2,55ppm.
- Hiệu suất hồi đạt yêu cầu với %R trung bình 81,52%.
3. Dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC nói trên, đã xác định được điều kiện thích hợp để xà phòng hoá lutein ester từ hoa cúc vạn thọ như sau:
- Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4% w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.
- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C. - Thời gian xà phòng hoá là 80 phút.
Với hiệu suất thu hồi lutein của quá trình xà phòng hoá 83,3% và hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích đạt 67,9%, ta hoàn toàn có thể ứng dụng phương pháp trong nghiên cứu này vào các nghiên cứu tiếp theo về lutein hoặc các carotenoid khác.
4.2. KIẾN NGHỊ
Để có những cơ sở chắc chắn hơn về phương pháp HPLC đã xây dựng, cần có những nghiên cứu thêm về ứng dụng của phương pháp lên các mẫu thực như hoa tươi, hoặc các sản phẩm về lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Miroslav ŠIVEL, Stanislav KRÁČMAR, Miroslav FIŠERA, Bořivoj KLEJDUS, Vlastimil KUBÁŇ, 2014, Lutein Content in Marigold Flower (Tagetes erecta L.) Concentrates used for Production of Food Supplements, Czech J. Food Sci., 32(6): 521–525.
[2] Johnson, E. J. (2002). The role of carotenoids in human health.
Nutrition in clinical care, 5(2), 56-65.
[3].Koushan, K., Rusovici, R., Li, W., Ferguson, L. R., & Chalam, K. V. (2013). The role of lutein in eye-related disease. Nutrients, 5(5), 1823- 1839.
[4]. Bộ Y Tế, 2012, Thông tư Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm, Số: 27/2012/TT-BYT (20/11/2012).
[5]. Gregory, G. K., CHEN, T. S., & PHILIP, T., 1986, Quantitative analysis of lutein esters in marigold flowers (Tagetes erecta) by high performance liquid chromatography. Journal of Food Science, 51(4), 1093-1094.
[6]. Ausich, R.L., Sanders, D. J., 1997), Process for the formation, isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants,
US Patent: 5,648,564.
[7]. Kumar, S. T. K., Abdnlkadir; S. P., Sebastian, S., 2004, Process for the preparation of xanthophyll crystals, US Patent, 6,743,953 B2.
[8]. Swaminathan, S., Madavalapil, K.P., 2009, Isolation and purification of carotenoids from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.
[9]. Sarkar, C.R., Bhagawati, B., Das, L., Goswami, B.C., 2012, An efficient condition of Saponification of Lutein ester from marigold flower,
J. Annals of Biological Research, 3 (3):1461-1466.
[10]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A., 2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables, J. Food Chem., 92: 753-763.
[11]. Cantrill, R., 2004, Lutein from Tagetes erecta: Chemical and
Technical Assessment, 63rd, JECFA.
[12]. JECFA 2004, Lutein from Tagetes erecta, Vol 4: 1–4.
[13]. Hoàng Thị Huệ An, 2009, Nghiên cứu định lượng astaxanthin và carotenoid đi kèm trong đối tượng thủy sản bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Hóa Phân tích,
Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
[14]. Trương Ngọc Bảo Hiếu, Ngô Văn Tứ, 2017, Phân tích hàm lượng b- caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Hue University J. Science: Natural
Science, 126 (1D)
[15]. Ranjita Shegokar, Khalil Mitri, 2012, Carotenoid Lutein: A Promising Candidate for Pharmaceutical and Nutraceutical Applications,
Journal of Dietary Supplements, 9(3):183–210.
[16]. Updike, A. A., & Schwartz, S. J., 2003, Thermal processing of vegetables increases cis isomers of lutein and zeaxanthin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(21), 6184-6190.
[17]. Philip, T., 1977, Purification of lutein-fatty acid esters from plant materials, US. Patent, 4,048,203.
[18]. S. Madavalapil, K. P., 2009, Isolation and purification of carotenoids from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.
[19]. Britton, G., 1995, Structure and properties of carotenoids in relation
to function, The FASEB Journal, 9, 1551-1558.
[20]. Craft, N. E., Soares, J. H., 1992, Relative Solubility, Stability, and Absorptivity of Lutein and b-Carotene in Organic Solvents, J. Agric.Food
Chem., 40(431-434).
[21]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A., 2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables, J. Food Chem., 92, 753-763.
[22]. Karawya, M.S., Hammouda, F.M., S.I. Ismail, A.K. Zaki, N.M. Nazif, 1996, HPLC and MS analyses of lutein – ester from Tagetes Patuia L., Quatar Univ. Sci. J., 16(2), 251 – 255.
[23]. Khachik, F., 1995, Process for isolation, purification and recrystallization of lutein from saponified marigold oleoresin and uses thereof, US. Patent, 5,382,714
[24]. Ribaya, J. D., Jeffrey, B. B., 2004, Lutein and Zeaxanthin and Their Potential Roles in Disease Prevention, J. Amer. College of Nutri., 23 (6), 567- 587.
[25]. Shao, A., 2001, The role of Lutein in Human Health, American
Nutraceutical Association (JANA), 4(2), 8-19.
[26]. Thorne Research, Inc., 2005, Lutein and Zeaxanthin, Alt. Med.
Review, 10(2), 128-135.
clastogenicity /anti-clastogenicity of lutein from marigold flowers, Food
& Chem. Toxic., 44: 1522–1529.
[28]. Deutsch, M.J., 1984, Vitamins and other nutrients. Williams, S. (Ed.). Official methods of analysis of the AOAC, 14th ed. Virginia,
Association of Official Analytical Chemists, 1984, 834-835.
[29]. EFSA, 2010, Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E 161b) as a food additive, EFSA Journal, 8(7):1678.
[30]. John, T.L., Richard, A.B., 2001, Lutein, Zeaxanthin, and the Macular Pigment, Archives of Biochem. & Biophys., 385(1), 28 - 40.
[31]. Tso, M. O. M, Lam, T. T., Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage, US. Patent, 5527533.
[32]. http://vietnamnet.vn/vn/doi-song/suc-khoe/99497/phat-hien-moi-ve- kha-nang-ho-tro-tri-nao-cua-lutein.html
[33]. Johnson, E.J., 2012, A possible role for lutein and zeaxanthin in cognitive function in the elderly, Am. J. Clin. Nutr., doi: 10.3945/ajcn.112.034611, USA, 1S-5S.
[34]. WHO, 2006, Safety evaluation of certain food additives, WHO Food Additives, Series: 54, WHO Press, Geneva.
[35]. Kale, S, Gaikwad, M, Bhandare, S., 2011, Determination and comparison of in vitro SPF of topical formulation containing Lutein ester from Tagetes erecta L. flowers, Moringa oleifera Lam seed oil containing Lutein ester, International Journal of Research in Pharmaceutical and