CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
2.2. PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN Bacillus subtilis
2.2.1 Chủng vi sinh PGPR
Chủng giống gốc: giống gốc phải đƣợc đảm bảo là giống thuần chủng không bị tạp nhiễm, đã đƣợc phân lập và định danh một cách chính xác. Ở đây chúng tôi sử dụng chủng vi khuẩn là: chủng Bacillus subtilis GB03 đã đƣợc tách ra từ rễ cây trồng trên nền đất sạch và khơng nhiễm hóa chất.
Vi khuẩn Bacillus subtilis GB03 đã đƣợc nghiên cứu và phát triển thành sản phẩm tại Hàn Quốc do TS. Chang Ho Chung thuộc Viện Vật liệu Sinh học Jeonju, Hàn Quốc cung cấp tháng 5 năm 2018.
2.2.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị và mơi trƣờng ni cấy vi sinh, chủng vi khuẩn
- Dụng cụ: Các dụng cụ thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật: Đĩa petri, ống nghiệm, bình nón đã đậy nút bơng, pipet có nút bơng, que gạt, que cấy…Các dụng cụ trên phải sạch sẽ về mặt hóa học (khơng dính các chất hữu cơ, vơ cơ, thủy tinh cần phải trung tính) và sạch sẽ về mặt vi sinh vật học (khơng chứa bất kì tế bào vi sinh cũng nhƣ dạng nghỉ của chúng – các dụng cụ phải vô trùng).
-Thiết bị: tủ nuôi cấy vi khuẩn, tủ sấy, máy đo OD.
Tủ cấy Tủ sấy Máy đo OD
Hình 2.7. Một số thiết bị dùng trong nuôi cấy và đánh giá sự phát triển của vi
- Lựa chọn mơi trƣờng ni cấy vi khuẩn: Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn cơ bản nhƣ: LB (Peptone 10 g, Cao nấm men 5 g, NaCl 10 g).
2.2.3 Trình tự tiến hành
2.2.3.1. Ni cấy vi khuẩn
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis GB03 đƣợc lƣu trữ dƣới dạng sinh khối khơ. Tiến hành hoạt hóa lại chủng vi khuẩn trên mơi trƣờng ni cấy lỏng, nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 35 - 37oC trong vịng 24 giờ.
- Sau 24 giờ, lấy dịch ni cấy chuyển sang môi trƣờng thạch bằng phƣơng pháp cấy ria giữ trong tủ ấm 32ºC /24 giờ để xác định hình thái khuẩn lạc. Việc này giúp chúng ta xác định đƣợc giống gốc có thuần chủng hay khơng, có bị chết và bị tạp nhiễm trong quá trình bảo quản.
- Tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn xác định độ thuần. Khi đã xác định đƣợc, tiến hành nhân giống dịch thể. Lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa mới nhân truyền vào bình mơi trƣờng LB nhân giống dịch thể. Ni trên máy lắc 150 vịng/phút ở 35 – 37ºC trong 24 giờ.
- Xác định giá trị OD trong bình mơi trƣờng ni. Pha lỗng dịch nuôi sao cho giá trị OD = 0,5.
- Lấy 15 ml giống dịch thể có giá trị OD cấy truyền vào bình lên men chứa 150 ml dịch môi trƣờng (tỉ lệ 10 %). Nuôi trên máy lắc với các chế độ nhƣ trên trong 24 giờ.
2.2.3.2. Nuôi cấy vi khuẩn và nano
- Giống gốc đƣợc nuôi trên môi trƣờng LB, giá trị OD = 0,5.
Vi khuẩn với nano TiO2
Bước 1: Mẫu vi khuẩn nuôi trên đĩa thạch anh, dùng que cấy lấy vi
Bước 4: Mẫu gốc nano TiO2 30 g /100 ml pha loãng thành dung dịch Y
có nồng độ 3 µg/ml (1 ml mẫu gốc pha 99 ml H2O). Lấy dung dịch Y để dùng.
Bước 5: Pha loãng dung dịch Y và LB để tạo các nồng độ nano TiO2
khác nhau.
Bảng 2.2. Bảng các nồng độ nano TiO2 thử nghiệm với vi khuẩnNồng độ nano Vnano VLB Số lần Tổng số ống Mốc thời Nồng độ nano Vnano VLB Số lần Tổng số ống Mốc thời
STT TiO2 (µg/ml) dd Y (ml) lặp lại gian đo (gi)
(àl) 1 30 50 5 2 2ì5+1=11 4;8;12;24;48 2 40 66 5 2 2×5+1=11 4;8;12;24;48 3 50 83 5 2 2×5+1=11 4;8;12;24;48 4 60 100 5 2 2×5+1=11 4;8;12;24;48 5 100 167 5 2 2×5+1=11 4;8;12;24;48 6 0 (đối chứng 0 5 2 2×5=10 4;8;12;24;48 dƣơng)
(đối chứng âm: LB + nano mỗi loại 1 ống khơng có vi khuẩn)
Khảo sát OD các nồng độ nano TiO2 theo thời gian để đánh giá tác động của nồng độ nano TiO2 tới sự phát triển của vi khuẩn, từ đó lựa chọn nồng độ phù hợp.
Vi khuẩn với nano SiO2
Bước 1: Mẫu vi khuẩn nuôi trên đĩa thạch anh, dùng que cấy lấy vi
khuẩn cho vào 3 ống nghiệm chứa 5 ml LB trong 24 giờ.
Bước 2: Chuẩn bị 6 ống nghiệm chứa 10 ml LB.
Bước 4: Mẫu gốc nano SiO2 30 g /100 ml pha loãng thành dung dịch Y
có nồng độ 3 µg/ml (1 ml mẫu gốc pha 99 ml H2O). Lấy dung dịch Y để dùng.
Bước 5: Pha loãng dung dịch Y và LB để tạo các nồng độ nano SiO2
khác nhau.
Bảng 2.3. Bảng các nồng độ nano SiO2 thử nghiệm với vi khuẩnSTT Nồng độ nano Vnano VLB Số lần Tổng số ống Mốc thời STT Nồng độ nano Vnano VLB Số lần Tổng số ống Mốc thời
SiO2 (µg/ml) (µl) (ml) lặp lại gian đo (giờ)
1 20 50 5 2 2×4+1=9 4;8;24;48 2 30 66 5 2 2×4+1=9 4;8;24;48 3 40 83 5 2 2×4+1=9 4;8;24;48 4 50 100 5 2 2×4+1=9 4;8;24;48 5 100 167 5 2 2×4+1=9 4;8;24;48 6 0 (đối chứng 0 5 2 2×5=10 4;8;24;48 dƣơng)
(đối chứng âm: LB + nano mỗi loại 1 ống khơng có vi khuẩn)
Khảo sát OD các nồng độ nano SiO2 theo thời gian để đánh giá tác động của nồng độ nano SiO2 tới sự phát triển của vi khuẩn, từ đó lựa chọn nồng độ phù hợp.