2.4.1. Chuẩn bị niêm mạc tử cung
Thành công hay thất bại của 1 chu kỳ chuyển phôi đông lạnh trong TTTON phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố được xem là quan trọng nhất là chất lượng phôi sau rã đông và sự chấp nhận của nội mạc tử cung người mẹ. Chất lượng phôi có thể được đánh giá bằng các tiêu chuẩn về phôi học trong labo. Với các tiến bộ trong kỹ thuật trữ lạnh, chất lượng phôi sau rã đông ngày càng được cải thiện.
Có sự chuẩn bị niêm mạc tử cung đủ diều kiện để chuyển phôi trữ.
2.4.2. Rã đông phôi
Mỗi một phương pháp trữ lạnh và một môi trường trữ lạnh có một cách thức rã đông riêng. Nói chung các phôi được lấy ra khỏi bình trữ lạnh, được nhúng vào nước ấm 37 oc hoặc vào môi trường rã đông ở 37 oc. Phôi được chuyển qua môi trường rã đông với nồng độ giảm dần, cuối cùng là môi trường đệm để chất bảo vệ từ từ thoát khỏi tế bào. Sau khi rã đông phôi được cho vào môi trường nuôi cấy, có thể chuyển sau ít nhất 2 giờ sau rã đông.
Như đã giới thiệu trên phần các giai đoạn phát triển của phôi, hiện tượng thoát màng thường xảy ra vào ngày thứ 5 hay 6, lúc này phôi đã di chuyển vào buồng tử cung. Ở người hiện tượng này xảy ra tại một vùng trên bề mặt của phôi nang. Phôi dần dần thoát ra khỏi màng trong suốt bằng cách lồi qua một lỗ nhỏ. Hiện tượng thoát màng hoàn toàn là lúc phôi chui ra khỏi màng trong suốt, thường xảy ra vào ngày thứ 6 hay 7.
Hình 2. 1. Phôi thoát khỏi màng bao xung quanh
Trong một số trường hợp phôi nang có thể gặp trở ngại trong vấn đề giãn nở hay chỉ dãn rộng ở một vài chỗ hoặc không thể giãn nở hoàn toàn để thoát khỏi màng trong suốt, cuối cùng nang xẹp xuống và thoái hóa, dẫn tới thất bại làm tổ của phôi. Phôi thất bại làm tổ là một trong những nguyên nhân thất bại của thụ tinh trong ống nghiệm. Từ đó kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng ra đời nhằm hỗ trợ cho phôi thoát khỏi màng trong suốt để làm tổ trong tử cung người mẹ. Hỗ trợ phôi thoát màng (Assisted hatching) đã được thực hiện từ những năm đầu của thập niên 90 bằng cách làm mỏng hoặc tạo một lỗ thoát trên màng của phôi nhằm cải thiện tỉ lệ có thai và tỉ lệ làm tổ của phôi. Có 4 cách để hỗ trợ phôi thoát màng:
- Phương pháp cơ học.
- Phương pháp hóa học (acid Tyrode)
- Phương pháp sinh hóa (men thủy phân protein) - Phương pháp laser.
Sau một loạt các tranh cãi về vấn đề có nên áp dụng thường quy kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng hay nghi vấn về việc có phải kỹ thuật này làm tăng tỷ lệ song thai đồng hợp tử trong TTTON, ngày nay các nhà phôi học chỉ áp dụng
hỗ trợ phôi thoát màng cho một số trường hợp nhất định mà tỉ lệ làm tổ và tỷ lệ có thai có thể cải thiện rõ rệt, như:
- Bệnh nhân thất bại nhiều lần mặc dù chất lượng phôi tốt - Bệnh nhân chuyển phôi trữ lạnh
- Bệnh nhân ít phôi, lớn tuổi
- Bệnh nhân có phôi có màng trong suốt dày bất thường
- Bệnh nhân thực hiện kỹ thuật trưởng thành trứng trong ống nghiệm (IVM).
2.5. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2. 2. Sơ đồ nghiên cứu
Những bệnh nhân được chỉ định chuyển phôi nang trữ đông, sẽ được chuẩn bị hồ sơ có đầy đủ thông tin và tiến hành các bước như sơ đồ trên. Ở trung tâm chúng tôi phôi được trữ theo phương pháp thủy tinh hóa và rã cũng theo protocol của hãng Cryotech (Nhật Bản).
Phương pháp rã đông phôi : Phôi được rã đông theo các trình tự sau: Bước 1 : phôi từ Nito lỏng được nhúng vào môi trường TS ở 37°C – để trong 1 phút.
vòng 3 phút.
Bước 3 : hút phôi chuyển vào 300 µl môi trường WS1 ủ trong vòng 5 phút. Bước 4 : chuyển phôi vào 300 µl môi trường WS2, rửa phôi 2 lần bằng pipette Pasteur, trong vòng 1 phút. Sau đó chuyển phôi để ủ vào môi trường nuôi cấy sau rã đông.
Phương pháp rã đông phôi : Phôi được rã đông theo các trình tự sau: Bước 1 : Phôi được lấy từ Nito lỏng được nhúng vào môi trường TS ở 37°C – để trong 1 phút.
Bước 2 : Sau đó phôi được chuyển vào 300 µl môi trường (DS) ủ trong vòng 3 phút.
Bước 3 : Hút phôi chuyển vào 300 µl môi trường WS1 ủ trong vòng 5 phút.
Bước 4 : Chuyển phôi vào 300 µl môi trường WS2, rửa phôi 2 lần bằng pipette Pasteur, trong vòng 1 phút. Sau đó chuyển phôi để ủ vào môi trường nuôi cấy sau rã đông.
Hình 2. 3. Quy trình rã đông phôi
đảo ngược và đồng thời chụp hình ảnh phôi đó để gửi kết quả kèm theo hình ảnh phôi chuyển cho bệnh nhân.
2.5.2. Đánh giá phôi nang
* Đánh giá hình thái phôi nang theo tiêu chuẩn Gardner 1999. + Bước 1: Đánh giá độ nở của khoang phôi nang và hiện tượng thoát màng
Độ 1: Phôi nang sớm: thể tích khoang dịch <1/2 thể tích của phôi. Độ 2: Phôi nang: khoang dịch chiếm ≥1/2 tổng thể tích của phôi. . Độ 3: Phôi nang đầy: khoang dịch chiếm hầu hết thể tích phôi.
Độ 4: Phôi nang nở rộng: khoang dịch phát triển rộng làm cho màng ZP bắt đầu mỏng dần.
Độ 5: Phôi nang đang thoát màng: khi TE bắt đầu thoát ra khỏi màng trong suốt.
Độ 6: Phôi nang đã thoát màng: khi phôi nang đã thoát TE ra khỏi màng trong suốt.
+ Bước 2: Đánh giá ICM, TE
Khi khoang phôi nang phát triển từ độ 2 trở lên, thì có thêm những mô tả chi tiết về 2 loại tế bào xuất hiện là tế bào lá nuôi (TE) và nụ phôi (tế bào mầm- ICM). Theo hệ thống đánh giá này thì cũng chia lá nuôi và nụ phôi thành 3 loại dựa trên số lượng và sự gắn kết của các tế bào.
Theo tác giả Capalbo và cộng sự (2014) và tác giả Gonzalez X (2019) [53] [54] thì đánh giá và phân lọa ICM, TE như sau:
Đánh giá ICM:
Loại A: Nổi bật, quan sát rõ, có nhiều tế bào kết khối và liên kết chặt. Loại B: Có thể quan sát rõ, nhiều tế bào nhưng không liên kết chặt.
Loại C: Khi có rất ít tế bào, khó quan sát. Khó quan sát, có rất ít tế bào, liên kết lỏng lẻo hoặc phân mảnh.
Loại D: Rất ít tế bào, không phân biệt được ICM Đánh giá TE:
Loại B: Có thể quan sát rõ, nhiều tế bào nhưng không liên kết chặt vẫn đẹp nhưng không bằng A.
Loại C: Rất ít tế bào,kém các tế bào lớn phân bố không đều (ít tế bào bị ép sang hai bên). Theo tác giả và cộng sự (2014) và tác giả Gonzalez X (2019)
Loại D: Rất ít tế bào và chất lượng kém hoặc TE thoái hoá.
Theo đánh giá chất lượng phôi nang trong nghiên cứu theo tác giả Gardner D. K. (1999), tác giả Capalbo và cộng sự (2014) và tác giả Gonzalez X (2019) Từ đó phân loại chất lượng hình thái phôi nang thành 4 độ tương ứng lần lượt là phôi nang có chất lượng tốt, trung bình và xấu.
Bảng 2. 1. Phân loại chất lượng hình thái phôi nang Phân loại Chất lượng hình thái phôi nang Độ I (rất tốt) (3-6) AA
Độ II (tốt) (3-6) AB hoặc (3-6) BA, hoặc 2AA, (5-6) BB Độ III (trung bình) (2-4) BB hoặc (3-6) AC
(3-6) CA hoặc 2(AB, BA, BB) Độ IV (xấu/kém) (2-6) CB hoặc (2-6) BC
(2-6) CC hoặc 2(AC, CA)
Phôi 4AA – Độ I Phôi 4BA – Độ II
Phôi 3BB – Độ III Phôi 2CC – Độ IV (Nguồn:
Atlas of human embryology from oocytes to Preimplantation embryos) [25] Hình 2. 4. Một số hình ảnh phôi nang.
Tại Labo của Bệnh viện HTSS và Nam học Đức Phúc chúng tôi đã hỗ trợ thoát màng thường quy ngày 3. Do vậy, nghiên cứu này chúng tôi không đánh giá về ảnh hưởng của hỗ trợ thoát màng.
2.5.3. Biến số và chỉ số nghiên cứu
2.5.3.1. Biến số
Đặc điểm của đối tượng tham gia nghiên cứu: + Tuổi mẹ
+ Niêm mạc tử cung ngày chuyển phôi
Đặc điểm của phôi nang: đánh giá theo tiêu chuẩn của Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và nam học Đức Phúc:
+ Tuổi phôi
+ Phân độ hình thái: Rất tốt, tốt, trung bình và xấu + Hình thái ICM: loại A-B-C
+ Hình thái lớp TE: loại A-B-C Kết quả thai:
+ Thai tiến triển: có hay không + Mất thai: có hay không
2.5.3.2. Các chỉ số
Đặc điểm chung của đối tượng tham gia nghiên cứu: + Tuổi mẹ trung bình
+ Tỷ lệ thai tiến triển chung + Chỉ số sống sót
+ Tỷ lệ có thai + Tỷ lệ làm tổ
+ Tỷ lệ thai lâm sàng + Tỷ lệ trẻ sinh sống
2.5.3.3. Một số khái niệm và cách đánh giá dùng trong nghiên cứu
Tỷ lệ sống sau rã đông = Số phôi sống sau rã
Tổng số phôi đông X 100%
Tỷ lệ làm tổ = Số túi ối siêu âm được
Tổng số phôi chuyểnX100% Tỷ lệ β-hcg (+) = Tổng số ca có β−hcg (+)
Tổng số chu kỳ chuyển phôiX100%
Tỷ lệ thai lâm sàng = Tổng số chu kỳ siêu âm có túi thai
Tổng số chu kỳ chuyển phôi X100%
Tỷ lệ phôi nang tốt= Tổng số phôi nang tốt
679 phôi được nghiên cứuX100%
Phôi thoái hóa là phôi có >50% các phôi bào co nhỏ, đen sậm, không giãn nở trở về trạng thái giống trước khi đông.
Thai lâm sàng được chẩn đoán khi siêu âm có túi ối trong BTC
Đa thai là hiện tượng có sự phát triển từ hai thai trong buồng tử cung + Tuổi phôi: phôi nang ngày 5 được đánh giá vào thời điểm giờ thứ 116 ±1, phôi nang ngày 6 được đánh giá vào thời điểm giờ thứ 140 ± 1 (thời điểm 0 giờ là thời điểm thực hiện ICSI).
+ Tuổi của mẹ: Tính theo năm dương lịch (từ năm sinh ra cho đến thời điểm chuyển phôi).
Thai tiến triển: thai phát triển sau 12 tuần.
2.5.4. Quản lý và xử lý số liệu
không cần thiết, không phù hợp với mục tiêu nghiên cứu.
Tiến hành nhập số liệu, xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0 một cách lần lượt, hệ thống, tránh nhập thừa hay bỏ sót số liệu.
Sử dụng các phép toán thống kê mô tả cho các biến định tính và định lượng, kiểm định giả thuyết bằng test Khi bình phương và so sánh tỷ lệ trung bình của 2 nhóm, tính tỉ suất chênh OR.
Vẽ các biểu đồ bằng phần mềm Excel.
2.5.5. Sai số và phương pháp khống chế sai số
Sai số được khống chế bằng cách lựa chọn đối tượng theo tiêu chuẩn nghiên cứu.
* Sai số trong quá trình thu thập số liệu được khống chế bằng cách: Phiếu nghiên cứu được thiết kế và thử nghiệm trước khi nghiên cứu.
Người lấy mẫu đảm bảo lấy chính xác, tỉ mỉ những thông tin được lưu lại trong hồ sơ bệnh án đúng theo yêu cầu nghiên cứu của đề tài.
Số liệu được thu thập và xử lý nghiêm túc, chính xác.
2.6. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu chỉ hồi cứu trên bệnh án, không can thiệp trên người bệnh, không làm sai lệch kết quả điều trị của bệnh nhân.
Nghiên cứu chỉ với mục đích phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe nhân dân, không nhằm mục đích nào khác. Đảm bảo quy định về đạo đức trong nghiên cứu y học của Bộ đã quy định.
Các thông tin về bệnh nhân sẽ được bảo mật theo đúng qui định của pháp luật hiện hành.
Tiến hành nghiên cứu với tinh thần trung thực.
Nghiên cứu này được tiến hành sau khi đề cương nghiên cứu đã được sự chấp thuận của hội đồng khoa học, đạo đức của Học Viện Khoa học và Công Nghệ, lãnh đạo Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc.
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Trong 8 tháng kể từ tháng 1 đến tháng 8 năm 2021, chúng tôi thu thập được 365 chu kỳ chuyển phôi nang đông lạnh tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc thỏa mãn với các tiêu chuẩn nghiên cứu.
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ LẠNH LẠNH
3.1.1. Tuổi
Phân bố nhóm tuổi của bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu được thể hiện qua hình 3.1
Hình 3. 1. Phân bố nhóm tuổi bệnh nhân Tuổi của bệnh nhân chuyển phôi từ 19 đến 57.
Trong đó, nhóm nghiên cứu gồm phần lớn bệnh nhân đang ở độ tuổi sinh sản, dưới 35 tuổi là 238 bệnh nhân chiếm 65.21% số trường hợp nghiên cứu,
Tuổi trung bình của người vợ là 33±6.
Số phôi chuyển trung bình trên một chu kỳ là 1.86±0.42/ 1 chu kỳ chuyển phôi.
3.1.2. Chất lượng phôi trước đông
128 110 92 35 0 50 100 150 Dưới 30 30-34 35-40 Tuổi >40 Số ch u kỳ ch uy ển p hô i Nhóm tuổi
Hình 3. 2. Chất lượng trước khi đông
Trong 680 phôi nghiên cứu thì chất lượng phôi loại rất tốt, loại tốt là 536 phôi chiếm 78,82 % còn 146 phôi là phôi trung bình và xấu chiếm 21,18 %. Chất lượng phôi trước trữ đông như vậy cho thấy được tiềm năng chuyển phôi trữ cũng như là tiên lượng được kết quả của điều trị IVF.
3.1.3. Số lượng phôi chuyển
Hình 3. 3. Số lượng phôi chuyển
Số chu kỳ chuyển 2 phôi nhiều nhất chiếm 80,55%, và chuyển 1 phôi chiếm tỷ lệ 16,71%, đặc biệt chuyển 3 phôi rất ít chỉ chiếm 2,74%.
Số phôi chuyển trung bình trên 1 chu kỳ chuyển phôi là 1.86±0.42
149 387 110 34 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Rất tốt Tốt Trung bình Xấu Số lư ợn g ph ôi trư ớc đô ng
Chất lượng phôi trước khi đông lạnh
Chuyển 1 phôi 16.71%, N=61
Chuyển 2 phôi 80.55%,N=294
Chuyển 3 phôi 2.74%, N=10 Số lượng phôi chuyển
Chuyển 1 phôi Chuyển 2 phôi Chuyển 3 phôi
3.2. KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tỷ lệ sống của phôi sau rã đông
Tổng số có 685 phôi được rã đông trong đó có 5 phôi tái đông, 1 phôi thoái hóa và 679 phôi được chuyển cho 365 chuy kỳ được nghiên cứu.
Hình 3. 4. Tỷ lệ phôi sống sót
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ sống của phôi là 99,85%. Tỷ lệ sống cao như vậy bởi chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật đông rã Thủy tinh hóa (Vitrification) kỹ thuật này cho tỷ lệ sống cao hơn kỹ thuật đông phôi chậm nên số phôi sống sau rã đông là gần như 100%. Tỷ lệ sống này nó cũng phụ thuộc vào kỹ năng thao tác, chất lượng của môi trường sử dụng.
3.2.2. Chất lượng của phôi sau rã đông
Hình 3. 5. Chất lượng phôi chuyển 99.85%
0.15% Tỷ lệ sống sót của phôi sau
Tỷ lệ sống sót (%), N=679 Tỷ lệ thoái hóa(%), N=1 0 200 400 600 800 Tổng Rất tốt Tốt Trung bình Xấu 679 148 379 111 41 Tổng số phôi chuyển C hấ t l ượng phôi
Tổng số có 679 phôi chuyển, số phôi tốt và rất tốt chiếm 77,61%. Số còn lại là phôi trung bình, xấu chiếm 22,39%.
3.2.2.1 Đánh giá hình thái lá nuôi
Đánh giá hình thái lá nuôi (TE) theo tiêu chuẩn Gardner D. K1999, chúng tôi thu được kết quả như sau:
Hình 3. 6. Hình thái lá nuôi
Tổng có 679 phôi được nghiên cứu, số phôi có tế bào lá nuôi loại A và loại B là 568 phôi chiếm 83,65%. TE loại C là 111 chiếm 16.35%.
3.2.2.2 Đánh giá hình thái ICM
Đánh giá hình thái nụ phôi (ICM) theo tiêu chuẩn Gardner D. K 1999, chúng tôi thu được kết quả như sau:
Hình 3. 7. Hình thái ICM 22.97%
60.68% 16.35%
Đánh giá hình thái TE
Loại A, N=156 Loại B, N=412 Loại C, N= 111
21.80%
56.55% 21.65%
Đánh giá hình thái ICM( %)
A và loại B là 532 phôi chiếm 78,35%.
Bảng 3.1.So sánh chất lượng phôi trước và sau rã đông Chất lượng Trước đông lạnh Sau rã đông
Rất tốt 149 148
Tốt 387 379
Trung bình 110 111
Xấu 34 41
Tổng N=680 N=679(1 phôi thoái hóa)
Phôi rất tốt chỉ 1 phôi chuyển sang phôi tốt, phôi tốt thì 9 phôi chuyển xuống trung bình, còn phôi trung bình 8 phôi chuyển sang phôi xấu và 1 phôi xấu trước đông bị thoái hóa sau rã đông.
3.2.3. Kết quả thai sau chuyển phôi