M 雲 A井 U
2.3. B嘘 trí thí nghi羽 m
405030"A員e"8k吋o"j·pj"vjƒk"8衣i th吋, vi th吋 a. Nguyên t逸c
Quan sát và mô t違 hình d衣pi"m ej"vj逢噂c và màu s逸c khu育n l衣c c栄a Lc.lactis. Swcp"uƒv"f逢噂i kính hi吋p"xk"8吋 zƒe"8鵜nh hình d衣ng t院 bào, kh違 p<pi"d逸t màu qua rj逢挨pi"rjƒr"pjw瓜m Gram.
b. Ti院n hành
Swcp"uƒv"8員e"8k吋m hình d衣ng khu育n l衣c: s穎 d映pi"rj逢挨pi"rjƒr"e医y trang ch栄ng Lc.lactis vt‒p"o»k"vt逢運ng MRS agar, 栄eƒe"8 c"vj衣ch 荏 37oC.
Nhu瓜m Gram: d詠a vào kh違p<pi"d逸t màu khác nhau c栄a vi khu育p"Itco"f逢挨pi" x "Itco"¤o"8逢嬰e"sw{"8鵜nh b荏i vách t院 bào mà ti院n hành nhu瓜o"Itco"8吋 xác 8鵜nh Lc.lactis thu瓜c lo衣i nào.
Eƒe"d逢噂c nhu瓜m Gram
- Dàn m臼ng vi sinh v壱t thành v院v"d»k."8吋 khô trong không khí. - C嘘8鵜nh nh姻 trên ng丑n l穎c"8flp"e欝n.
- Nhu瓜m tiêu b違n v噂i dung d鵜ch Crystal violet trong 1 phút. - Nhu瓜m Lugol trong 0,5 phút, r穎c"p逢噂c.
- T育y b茨ng c欝n, r穎c"p逢噂c.
- Nhu瓜m màu b鰻 sung trong 30 giây b茨ng Fushin, r穎c"p逢噂e."8吋 khô t詠 nhiên. - Swcp"uƒv"f逢噂i kính hi吋n vi 100X có d亥u soi kính.
405040"Vƒk"8鵜nh danh gi嘘ng thu亥n b茨ng b瓜 kit API 50 CHL
Nguyên tｈc: áp d映ng kh違 p<pi"n‒p"ogp"eƒe"piw欝n cacbohydrat khác nhau c栄a nh英ng ch栄pi"mjƒe"pjcw"8吋 phân bi羽t chúng. Khi vi khu育n lên men ngu欝n cacbon chúng s胤 sinh axit, làm gi違o"rJ"o»k"vt逢運ng và làm cho ch医t ch雨 th鵜 bromocresol rwtrng"vtqpi"o»k"vt逢運ng chuy吋n t瑛 màu tím thành màu vàng. K院t qu違 8逢嬰c xem xét theo s詠8鰻i màu hay không c栄c"o»k"vt逢運ng 荏 t瑛ng gi院pi."ucw"8„"u胤8逢嬰c x穎 lý b茨ng ph亥n m隠o"8鵜nh danh API 50 CHL.
33 Thばc hiうn:
C医y ria gi嘘pi"vt‒p"o»k"vt逢運ng MRS agar, 栄 k液 khí 荏 37oC trong 24-48 gi運 8吋 thu nh壱n khu育n l衣e"8挨p0"Ucw"8„"v衣o huy隠n phù t院 bào v噂i các khu育n l衣e"vjw"8逢嬰c. Dùng pipet chuy吋n m瓜t ít d鵜ch t院 bào vào các gi院ng th穎 nghi羽o"x "8go"栄荏 37oC trong 24 gi運. Quan sát s詠8鰻i màu ch医t ch雨 th鵜 荏 các gi院ng. Ghi nh壱n k院t qu違. X穎 lý k院t qu違 b茨ng ph亥n m隠o"8鵜nh danh API 50 CHL.
405050"Z¤{"f詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏pi
ﾓXây d詠pi" 8逢運ng chu育n b茨pi" rj逢挨pi" rjƒr" 8院m khu育n l衣c trên môi vt逢運ng th衣ch.
V<pi"ukpj"gi嘘ng vi khu育n trong 5 on"o»k"vt逢運ng MRS, nuôi c医y 24 gi運, 37ºC. V<pi"ukpj"e医p 2: hút 5 ml d鵜ej"v<pi"ukpj"ejq"x q"45 on"o»k"vt逢運ng MRS (t雨 l羽 c医y gi嘘ng là 10%), ti院n hành nuôi c医y 24 gi運, 370C.
Pha loãng d鵜ch huy隠n phù t院 bào khác nhau sao cho giá tr鵜 OD610 c栄a các d鵜ch pha loãng có các giá tr鵜 l亥p"n逢嬰t là 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. M磯u tr逸pi"n "o»k"vt逢運ng MRS không ch泳a khu育n.
Hút 1 mL d鵜ch huy隠n phù t院 bào 荏 eƒe"8瓜 rjc"nq«pi"v逢挨pi"泳ng v噂i các giá tr鵜 QF"vt‒p"8go"rjc"nq«pi""vk院p"j pj"zƒe"8鵜nh m壱v"8瓜vjgq"rj逢挨ng pháp vi sinh.
ﾓXây d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng c栄a Lactococcus lactis.
T瑛8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng, ta ch丑n th運k"8k吋m thu bacteriocin thích h嬰p. Kh違q"uƒv"8逢運ng sót theo th運i gian nuôi c医y.
V<pi"ukpj"gi嘘ng Lactococcus lactis vào các 嘘ng nghi羽n ch泳a 5ml o»k"vt逢運ng MRS, ti院n hành nuôi c医y 24 gi運, 370C.
Ch栄ng gi嘘ng 8逢嬰c nuôi c医y trong 15 m磯u, m厩i m磯u ch泳a 20 ml o»k"vt逢運ng MRS l臼ng, t益 l羽 c医y gi嘘ng là 10%, pH 6, 370C. Cách hai gi運, m瓜t m磯w"8逢嬰c l医y, 8q"QF610."rJ."8逢運ng sót.
T瑛 giá tr鵜 OD610 d詠c"x q"8逢運pi"v逢挨pi"swcp"vw{院p"v pj"vc"v pj"8逢嬰c m壱v"8瓜 t院 bào t衣i các th運k"8k吋o"v逢挨pi"泳ng. N院u giá tr鵜 h医p thu l噂p"j挨p"2.:"vj·"e亥n pha loãng m磯u (m嘘i quan h羽 tuy院n tính gi英c"8瓜 h医p thu và n欝pi"8瓜 t院 bào trong m磯u ch雨 8¿pi"vtqpi"o瓜t gi噂i h衣n nh医v"8鵜nh).
34
Ucw"8„."n{"v¤o"f鵜ch lên men 4000 vòng/phút, 20 phút và thu d鵜ch n鰻i. M瓜t ph亥n d鵜ch n鰻k"p {"f́pi"8吋8q"8逢運ng sót b茨pi"rj逢挨pi"rjƒr"FPU0
M瓜t ph亥n d鵜ch sau nuôi c医{"8逢嬰c ch雨nh pH v隠 6 b茨ng NaOH 1N. D鵜ch lên men sau khi x穎 lí có ch泳a bacteriocin. D鵜ch lên men 8逢嬰c kh違o sát ho衣t tính kháng khu育n nh茨m ch丑n th運k"8k吋m thu bacteriocin thích h嬰p. Th運i gian nuôi c医y này s胤 8逢嬰c s穎 d映ng trong các thí nghi羽m ti院p theo.
2.3.4. Kh違q"uƒv"8k隠u ki羽n nuôi c医y x "o»k"vt逢運pi"fkpj"f逢叡ng trong lên men batch
2.3.4.1. Kh違o sát pH t嘘k"逢w"e栄a quá trình nuôi c医y
C医y gi嘘ng t益 l羽 10% t瑛o»k"vt逢運ng nhân gi嘘ng c医p 1 vào các 嘘ng nghi羽m ch泳a o»k"vt逢運ng MRS có pH dcp"8亥w"8i隠u ch雨nh v隠 4; 5; 6; 7; 8. 曳 荏 370C trong th運i gian t嘘k"逢w.
2.3.4.2. Kh違o sát nhi羽v"8瓜 nuôi c医y t嘘k"逢w
C医y gi嘘ng t益 l羽 10% t瑛o»k"vt逢運ng nhân gi嘘ng c医p 1 vào các 嘘ng nghi羽m ch泳a o»k"vt逢運ng MRS.
曳荏 các nhi羽v"8瓜 33; 35; 37; 39; 410C trong th運i gian t嘘k"逢w.
2.3.4.3. Kh違o sát t益 l羽 c医y gi嘘ng t嘘k"逢w
C医y gi嘘ng t益 l羽 2, 4, 6; 8; 10; 12% t瑛 o»k"vt逢運ng nhân gi嘘ng c医p 1 vào các 嘘ng nghi羽m ch泳c"o»k"vt逢運ng MRS.
曳荏 370C trong th運i gian t嘘k"逢w0
Các chえ tiêu theo dõi:
- A瓜8映c 荏 d逢噂c sóng 610nm (OD610) - Ho衣t tính kháng khu育n
T瑛8„"vc"v·o"tc"phi羽v"8瓜, pH và t益 l羽 c医y gi嘘ng t嘘k"逢w"ejq"swƒ"vt·pj"ukpj"vt逢荏ng c栄a Lactococcus lactis, dùng các giá tr鵜 t嘘k"逢w"p {"ejq"các thí nghi羽m ti院p theo.
2.3.4.4. Kh違o sát 違pj"j逢荏ng c栄a ngu欝n cacbon
35
O»k" vt逢運pi" OTU" 8逢嬰c thay th院 b荏i các ngu欝n 8逢運ng: glucose, fructose, lactose, sucrose v噂i j o"n逢嬰ng 20 g/l.
Thu d鵜ch lên men vtqpi"eƒe"o»k"vt逢運ng có các ngu欝p"8逢運ng trên. Kh違o sát OD, ho衣t tính kháng khu育n (AU/ml).
2.3.4.5. Kh違o sát 違pj"j逢荏ng c栄c"j o"n逢嬰ng cacbon
M映e" 8 ej<" v·o" j o" n逢嬰pi" 8逢運ng t嘘k" 逢w." pi逢叡ng 泳c ch院 sinh t鰻ng h嬰p bacteriocin.
Vc""8« ch丑p"8逢嬰c ngu欝p"8逢運ng thích h嬰p cho sinh t鰻ng h嬰p bacteriocin t瑛 thí nghi羽m trên.
O»k"vt逢運ng MRS l亥p"n逢嬰t thay th院 b荏i ngu欝p"8逢運ng này v噂k"j o"n逢嬰ng 10, 20, 52."62."72."82"92.":2.";2."Èi1n0
Thu d鵜ch nuôi c医y.
Kh違o sát OD, pH, ho衣t tính kháng khu育n (AU/ml).
2.3.5. Lên men fed Î batch
D詠a vào:
- N逢嬰pi"8逢運ng sót theo th運i gian nuôi c医{"8«"mj違o sát.
- Pi逢叡ng 泳c ch院: n欝pi"8瓜 8逢運ng mà t衣k"8„"ukpj"mj嘘i và ho衣t tính bacteriocin mj»pi"v<pi.
- Fw{"vt·"8k隠u ki羽n nuôi c医y và môi vt逢運pi"fkpj"f逢叡ng t嘘k"逢w0 A逢c"tc"ej院8瓜 fed-batch h嬰p lí.
- Kh違o sát sinh kh嘘i, ho衣t tính bacteriocin theo th運i gian.
Cách hai gi運, m瓜t m磯w"8逢嬰c l医{."8q"QF. X穎n "pj逢"vt‒p"8吋 thu d鵜ch lên men có ho衣t tính kháng khu育n.
Ch雨 tiêu theo dõi: OD, ho衣t tính kháng khu育n (AU/ml) theo th運i gian.
2.3.6. Kh違o sát 違pj" j逢荏ng n欝pi" 8瓜 d鵜ej" dcevgtkqekp" 8院n th運i gian b違o qu違n nguyên li羽u m壱t hoa d瑛a
Nguyên li羽u m壱t hoa d瑛a thu t瑛A欝ng Gò- B院n Tre.
36 - B嘘 trí thí nghi羽m:
AEo: 8嘘i ch泳pi"dcp"8亥u, m壱t hoa d瑛a sau khi thu nh壱n.
AE1<"8嘘i ch泳ng thí nghi羽m, m壱t hoa d瑛a nguyên ch医t theo th運i gian b違o qu違n. M磯u M1: b鰻 sung 0,1% d鵜ch bacteriocin vào m壱t hoa d瑛a.
M磯u M2: b鰻 sung 0,2% d鵜ch bacteriocin vào m壱t hoa d瑛a. M磯u M3: b鰻 sung 0,3% d鵜ch bacteriocin vào m壱t hoa d瑛a. M磯u M4: b鰻 sung 0,4% d鵜ch bacteriocin vào m壱t hoa d瑛a. M磯u M5: b鰻 sung 0,5% d鵜ch bacteriocin vào m壱t hoa d瑛a.
D鵜ej"dcevgtkqekp"8逢嬰c b鰻 sung vào d鵜ch nguyên li羽u m壱t hoa d瑛a theo t益 l羽 c栄a nghi羽m th泳e0"A員t lên máy l逸e"8違q"8吋8欝ng nh医t d鵜ch (200v/ ph, 5 phút)
- Các ch雨 tiêu theo dõi: Ch雨 tiêu vi sinh: t鰻ng s嘘 vi khu育n hi院u khí (TSVKHK), t鰻ng s嘘 n医m men Î n医m m嘘c (TSNM-NM); Ch雨 tiêu hóa sinh: 8逢運ng t鰻ng, pH.
Ch雨 tiêu vi sinh
M磯u nguyên li羽u m壱t hoa d瑛a sau khi b鰻 sung d鵜ej"dcevgtkqekp"8逢嬰c b違o qu違n 荏 nhi羽v"8瓜 phòng 30 -32oC
Ch雨 vk‒w"VUXMJM<"eƒe"8 c"vj衣ej"PC"ucw"mjk"vtcpi"8隠u m壱t hoa d瑛c"8逢嬰c 栄荏 nhi羽v"8瓜 37oC, sau 2 ngày ghi nh壱n s嘘n逢嬰ng khu育n l衣c xu医t hi羽n trên m員t th衣ch.
Ch雨 tiêu TSNM-PO<"eƒe"8 c"vj衣ej"RFC"ucw"mjk"vtcpi"8隠u m壱t hoa d瑛c"8逢嬰c 栄 荏 nhi羽v"8瓜 32oC, sau 2 ngày ghi nh壱n s嘘n逢嬰ng khu育n l衣c xu医t hi羽n trên m員t th衣ch.
Ch雨 tiêu hóa sinh
Nh茨m theo dõi s詠 vjc{" 8鰻i thành ph亥p" 8逢運ng t鰻ng, pH trong các m磯u b違o qu違n. Thí nghi羽m kh違o sát 違pj"j逢荏ng n欝pi"8瓜 ch医t b違o qu違p"dcevgtkqekp"8院n vi羽c phân gi違i ngu欝p"8逢運ng t衣q"p<pi"n逢嬰ng, t衣o ra các axit h英w"e挨"vtqpi"jq衣v"8瓜ng s嘘ng c栄a vi sinh v壱t.
M磯u nguyên li羽u m壱t hoa d瑛a sau khi b鰻 sung d鵜ej"dcevgtkqekp"8逢嬰c b違o qu違n 荏 nhi羽v"8瓜 phòng 30 - 32oC và l医y m磯u m厩k"pi {"8吋 ki吋m tra s詠vjc{"8鰻i hóa sinh.
37
2.3.70"Rj逢挨pi"rjƒr"rj¤p"v ej 40509030""Rj逢挨pi"rjƒr"xk"ukpj
a. Zƒe"8鵜nh m壱v"8瓜 vi sinh v壱t
Zƒe"8鵜nh m壱v"8瓜 vi sinh v壱t b茨pi"rj逢挨pi"rjƒr"8院m khu育n l衣e"vt‒p"o»k"vt逢運ng th衣ch.
Th詠c hi羽n:
Pha loãng m磯w" 8院n n欝pi" 8瓜 thích h嬰p, ch丑n 3 n欝pi" 8瓜 pha loãng liên ti院p pjcw0"Ijk"x q"8ƒ{"8 c"Rgvtk"e„"o»k"vt逢運ng th衣ch n欝pi"8瓜 pha loãng, ngày c医y.
Dùng pipet vô khu育n l医y 0,1 ml d鵜ch pha loãng cho vào m厩k"8 c"vj衣ch.
Dùng que c医y g衣t b茨ng th栄{"vkpj"f p"8隠u các t院 bào trên b隠 m員t th衣ej"x "8go" 栄荏8k隠u ki羽n thích h嬰p.
A院m s嘘n逢嬰ng khu育n l衣e"vtqpi"8 c"Î ch雨8院o"eƒe"8 c"e„"42"Î 200 khu育n l衣c. S嘘n逢嬰ng t院 bào vi sinh v壱t trong 1 ml m磯w"8逢嬰c tính theo công th泳c
Sぐ tｘ bào/ ml mｄu = (n/v) . D Vtqpi"8„<"
n Î s嘘 khu育n l衣c trung bình trong m瓜v"8 c"Rgvtk"荏 m瓜v"8瓜 pha loãng nh医v"8鵜nh. v Î th吋 tích d鵜ch m磯w"8go"e医y (0,1 ml).
D Î h羽 s嘘 pha loãng.
b. Ki吋m tra kh違p<pi"8嘘i kháng v噂i vi sinh v壱t gây h衣i b茨pi"rj逢挨pi"rjƒr" khu院ch tán qua gi医y l丑c (disc diffusion assay)
Th詠c hi羽n: Lc.lactis 8逢嬰c nuôi c医{"vtqpi"o»k"vt逢運ng MRS l臼ng.
Ucw"8„."n{"v¤o"f鵜ch lên men 4000 vòng/phút, 20 phút và thu d鵜ch n鰻i. D鵜ch lên men 8逢嬰c ch雨nh pH v隠 6 b茨ng NaOH 1N nh茨m lo衣i b臼vƒe"8瓜ng kháng khu育n c栄a các axit h英w"e挨"8逢嬰c sinh ra trong quá trình nuôi c医y. D鵜ch lên men sau khi x穎 lí ch泳a bacteriocin, d鵜ej"p {"8逢嬰c kh違o sát ho衣t tính kháng khu育n.
Th医m gi医y vào d鵜ej"n‒p"ogp"8«"z穎 n 0"A員t gi医y này lên b隠 m員t môi vt逢運ng NA 8«"vt違i vi khu育n ch雨 th鵜 vt逢噂e"8„0"曳swc"8‒o."mk吋m tra vòng kháng khu育n.
38
c. Zƒe"8鵜nh ho衣t tính bacteriocin
- Xác 8鵜nh ho衣v"v pj"dcevgtkqekp"*CW1on+"vjgq"rj逢挨pi"rjƒr"rjc"nq«pi"jck"n亥n liên ti院p (Schilliner và Rest). Zƒe"8鵜pj"8瓜 pha loãng cao nh医t cho th医y vòng kháng khu育p"x "zƒe"8鵜nh ho衣t tính bacteriocin (AU/ml) c栄a d鵜ch lên men:
CW<"8挨p"x鵜 ho衣t tính
DFi<"8瓜 pha loãng cao nh医t có vòng 泳c ch院
d. T鰻ng s嘘 vi khu育n hi院u khí
Nguyên t逸c: t鰻ng s嘘 vi khu育n hi院u khí ch雨 th鵜 cho m泳e"8瓜 v羽 sinh c栄a th詠c ph育m. Ch雨 s嘘p {"8逢嬰e"zƒe"8鵜nh b茨pi"eƒej"8院m s嘘 khu育n l衣c m丑e"vt‒p"o»k"vt逢運ng th衣ej"fkpj"f逢叡ng t瑛 m瓜v"n逢嬰ng m磯w"zƒe"8鵜nh thông qua s嘘 8挨p"x鵜 khu育n l衣c hình thành trong m瓜v"8挨p"x鵜 kh嘘k"n逢嬰ng th詠c ph育m.
Pha loãng m磯u: dùng pipet hút 1ml m磯u cho vào 嘘ng nghi羽m có ch泳a 9 ml p逢噂c c医v"x»"vt́pi."xqtvgz."vc"e„"8瓜 pha loãng 10-1, ti院p t映c ti院p"j pj"8吋e„"eƒe"8瓜 pha loãng khác nhau 10-2,10-3, 10-4.È
Th詠c hi羽n: tr違i 0,1 ml m磯u 荏 eƒe"8瓜rjc"nq«pi"mjƒe"pjcw"vt‒p"o»k"vt逢運ng NA, 栄 荏 nhi羽v"8瓜 37oE."ucw"4"pi {"8院m s嘘 khu育n l衣e"vt‒p"eƒe"8 c0"A院m s嘘 khu育n l衣c vt‒p"eƒe"8 c"e„"52"Î 300 khu育n l衣c. 雲 m厩i n欝pi"8瓜 pha loãng tr違k"5"8 c0
Tính s嘘 khu育n l衣c trung bình t瑛 eƒe" 8 c" épi" p欝pi" 8瓜 r欝i nhân v噂k" 8瓜 pha loãng, ghi nh壱n k院t qu違 A (cfu/ml) = i iVf n Vf n N - -... 1 1
Vtqpi"8„<" A Î s嘘 t院 bào vi khu育n trong 1ml m磯u.
N Î t鰻ng s嘘 khu育n l衣e"8院o"8逢嬰e"vt‒p"eƒe"8 c"8«"ej丑n. ni Î s嘘n逢嬰pi"8 c"e医y t衣q"8瓜 pha loãng th泳 i.
V Î th吋 tích d鵜ch m磯u (ml) c医y vào m厩k"8 c0 fi Î8瓜rjc"nq«pi"v逢挨pi"泳ng.
39
e. T鰻ng s嘘 n医m n医m men Î n医m m嘘c
Nguyên t逸c: bên c衣nh ch雨 tiêu t鰻ng s嘘 vi khu育n hi院u khí, t鰻ng s嘘 n医m men - n医m m嘘e"e pi"n "o瓜t ch雨 tiêu vi sinh ph鰻 bi院n trong th詠c ph育m. D詠a vào ch雨 tiêu p {"8吋8ƒpj"ikƒ"x隠 tình hình v羽 sinh s違n xu医t và d詠8qƒp"vj運i gian b違o qu違n th詠c ph育m.
Th詠c hi羽n: Pha loãng m磯w"8院n n欝pi"8瓜 thích h嬰p. M厩i m磯u nuôi c医y v噂i ít nh医v"5"8瓜 pha loãng khác nhau, s穎 d映pi"4"8 c"Rgvtk"ejq"o厩k"8瓜 pha loãng. Hút 0,1 ml m磯w"vtcpi"8隠w"n‒p"eƒe"8 c"vj衣ej"RFC."8員v"8 c"x q"v栄 栄 荏 nhi羽v"8瓜 32oC. Sau 5 ngày ti院p"j pj"8院m t鰻ng s嘘 khu育n l衣c xu医t hi羽n. Ch丑n nh英pi"8 c"Rgvtk"e„"v鰻ng s嘘 khu育n l衣c trong kho違ng 15 Î 150. T鰻ng s嘘 n医m men - n医m m嘘c s胤8逢嬰c bi吋u di宇n f逢噂i d衣ng s嘘 khu育n l衣c có trong 1 ml m磯u th詠c ph育m. Công th泳e"v pj"pj逢"v鰻ng s嘘 vi khu育n hi院u khí.
2.3.9040"Rj逢挨pi"rjƒr"j„c"ukpj
a. Zƒe"8鵜pj"n逢嬰pi"8逢運ng t鰻ng theo th運i gian lên men
Th栄{" rj¤p" 8逢運ng sucrose trong m磯u chuy吋n h院v" ucpi" 8逢運ng kh穎. B鰻 sung 57 n"fgzvtq¦{og"x q"32"on"o磯u, l逸e"8隠u, 栄 cách nhi羽t 荏 b吋8k隠u nhi羽t 63 Î 65oC trong 24 gi運. Th雨nh tho違ng l逸e" 8隠w." eƒe" 8逢運pi" mfir" 8«" 8逢嬰c th栄y phân thành 8逢運ng kh穎.
F́pi"rj逢挨pi"rjƒr"FPU"8吋zƒe"8鵜pj"j o"n逢嬰ng 8逢運ng kh穎 d詠a trên ph違n 泳ng t衣o màu gi英c"8逢運ng kh穎 v噂i thu嘘c th穎 3,5-Dinitrosalycylic axit (DNS). DNS có màu vàng trong dung d鵜ch ki隠m s胤 b鵜 kh穎 thành axit 3-amino-5-nitrosalycylic có o w"8臼eco0"E逢運pi"8瓜 màu c栄a h厩n h嬰p ph違n 泳ng t雨 l羽 thu壱n v噂i n欝pi"8瓜8逢運ng kh穎 trong m瓜t ph衣m vi nh医v"8鵜pj"8逢嬰e"8q"d茨ng máy quang ph鰻 so màu. D詠a theo 8欝 th鵜 8逢運ng chu育n glucose tinh khi院t v噂i thu嘘c th穎, ta s胤 v pj"8逢嬰c hàm l逢嬰ng 8逢運ng kh穎 c栄a m磯u nghiên c泳u. H嬰p ch医t t衣q" vj pj" e„" 8瓜 h医p thu m衣nh nh医t vtqpi"d逢噂c sóng 540nm.
Ti院n hành
Hút 3ml dung d鵜ch có m磯u ch泳c" 8逢運ng vào 嘘ng nghi羽m s衣ch và khô (pha loãng m磯u n院u c亥n). Thêm vào 1ml thu嘘c th穎 DNS. Chu育n b鵜 m磯u th穎 không b茨ng
40
cách thêm 1ml thu嘘c th穎FPU"x q"5on"p逢噂c c医t. B鵜v"m p"8亥u 嘘ng nghi羽m, 8員t vào n欝k"p逢噂e"8cpi"u»k"vtqpi"7"rj¿v0 Làm l衣nh v隠 nhi羽v"8瓜rj”pi."8q"8瓜 h医p thu 荏d逢噂c sóng 540nm. Ta s胤 so giá tr鵜 này v噂k"8逢運ng chu育p"8«"zƒe"8鵜nh.
Rj逢挨pi"vt·pj"8逢運ng chu育n: y = 0,242x - 0,089. R2 = 0,992. V噂i x là giá tr鵜 QF."{"n "n逢嬰ng glucose, mg/ml.
b. Rj逢挨pi"rjƒr"zƒe"8鵜nh pH
- Dùng pH k院.
- Cách ti院n hành: r穎a s衣ej"8k羽n c詠e"8q"rJ"d茨pi"p逢噂c c医t cho th壱t s衣ch, l医y gi医y th医o"ncw"8k羽n c詠c cho th壱t khô, l逸c nh姻 d鵜ch c亥p"8q"ucw"8„"pj¿pi"8k羽n c詠c vào d鵜ch c亥p"8q."pj医p"p¿v"8q."ej運 ejq"8院n khi con s嘘 hi羽n trên máy 鰻p"8鵜nh t泳c là swƒ"vt·pj"8q"m院t thúc, trên máy hi羽n s嘘 nào chính là pH c栄a d鵜ch c亥p"8q0
41
EJ姶愛PI"5. K蔭T QU謂 VÀ BI烏N LU一N
3.1. Tái 8鵜nh danh ch栄ng gi嘘ng
Swcp"uƒv"8衣i th吋 và vi th吋 ch栄ng kh違o sát cho th医y:
Ch栄ng có khu育n l衣e"vt”p."e„"8逢運ng kính t瑛 1 Î 1,5mm, màu tr逸ng s英a, b隠 m員t bóng, n鰻i lên theo ch鰻m c亥u, các khu育n l衣e"8欝ng nh医t. K院t qu違 nhu瓜m Gram cho th医y: t院 bào Lc.lactis là nh英ng t院 bào hình c亥u tr詠c khu育n."8泳ng riêng r胤 - t瑛pi"8»k" ho員c chu厩i và không có kh違p<pi"fk"8瓜ng
a)
b)
Hình 3.1. A員e"8k吋o"8衣i th吋, vi th吋 c栄a ch栄ng Lc.lactis
42
Vƒk" 8鵜nh danh ch栄ng gi嘘ng b茨ng b瓜 Kit API 50 CHL<" 8瓜 v逢挨pi" 8欝ng Lactococcus lactis 92%
Hình 3.2. K院t qu違vƒk"8鵜nh danh t瑛 b瓜 Kit API 50 CHL 3.2.Xây d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng ch栄ng Lc.lactis
3.2.1. Xây d詠pi"8逢運ng chu育n
Vt逢噂c khi xây d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng ta xây d詠pi"8逢運ng chu育n kh違o sát s詠 tuy院n tính gi英a m壱v"8瓜 t院 d q"x "8瓜 h医p thu quang ph鰻 OD t衣k"d逢噂c sóng 610 nm, k院t qu違 8逢運ng chu育n s胤 giúp ta th詠c hi羽n các kh違o sát sau nhanh chóng và ti羽n l嬰k"j挨p."8逢運ng chu育n có th吋 tin c壱y khi h羽 s嘘 R2 > 0.95.
A逢運ng chu育p" e„" rj逢挨pi" vt·pj" {" ?" 30499z" -" 902:7" x噂i y là m壱v" 8瓜 t院 bào (CFU/ml), x là m壱v"8瓜 quang c栄a m磯u, x có giá tr鵜 trong kho違ng 0.1- 0.5, khi x x逢嬰t quá kho違ng giá tr鵜 trên m磯u c亥p"8逢嬰e"rjc"nq«pi"8吋 n茨m trong kho違ng tuy院n
43
tính c栄c"8逢運ng chu育n, v噂i R2 ?"20;;5"8逢運ng chu育n có th吋 tin c壱y, d詠c"x q"8逢運ng chu育n ta ti院n hành d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng.
B違pi"5030V逢挨pi"swcp"ik英a OD610nm và m壱v"8瓜 t院 bào
OD610nm M壱v"8瓜 t院 bào (log CFU/ml)
0,3 8.35 0,316 9.75 0,377 10.73 0,474 12.28 y = 1.277x + 7.085 R² = 0.9933 0 2 4 6 8 10 12 14 0.3 0.316 0.377 0.474 O 壱v "8 瓜" "v院 ""d q"*n qi"E HW 1o n+ OD
44
3.2.2. Xây d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng
A逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng c栄a ch栄ng Lc. lactis 8逢嬰c th吋 hi羽p"vt‒p"8欝 th鵜 3.2.
A欝 th鵜 3.2. A逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng c栄a ch栄ng Lc. lactis
Vtqpi"8k隠u ki羽n kh違q"uƒv"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng th吋 hi羽n rõ 4 pha.