1.8.1. Cao xoa
Cao xoa, dầu xoa hay dầu cù là là tên gọi thông dụng của một dạng thuốc bôi ngoài da dạng sệt, đều màu, mịn, có mùi thơm đặc trưng của nguyên liệu, mà thành phần nguyên liệu chính trong đó là những chất hoặc hoạt chất thiên nhiên (tinh dầu) có tác dụng chính là giảm đau.
Cao xoa được cho là có tác dụng giảm đau nhức khi bôi vào vị trí cần thiết ngoài da. Tuy nhiên khác với các loại thuốc giảm đau như ibuprofen hoặc aspirin, cao xoa không trực tiếp tấn công vào nguồn gốc cơn đau. Nó tạo ra cái gọi là kích thích giảm đau (counterirritants): dùng các hóa chất thiên nhiên tạo cảm giác nóng nhưng không bỏng và mát mẻ luân phiên trên da để làm phân tán sự chú ý của não bộ. Nói cách khác, cao xoa không trực tiếp dập tắt cơn đau mà thay vào đó, nó tạo nên sự nhầm lẫn, đồng thời là sự thỏa mãn cho não bộ bằng hỗn hợp nhiều thành phần. (Nguyễn Ðức Ðoàn, 2002)
Hình 1.24. Một số loại cao xoa phổ biến ở Việt Nam
1.8.2. Thành phần
Cao xoa hay dầu cù là có 2 thành phần chủ yếu là tá dược và dược chất là các tinh dầu với công thức tùy thuộc công thức riêng của nhà sản xuất. Nhiều công thức làm cao xoa được xem là bí mật thương mại cũng như là công thức gia truyền nhiều đời không được công bố cho người ngoài.
Tá dược: là các chất không hoạt tính (dược lý hoặc sinh học) được lựa chọn để xây dựng công thức bào chế cùng với các thành phần hoạt chất khác của thuốc, nhằm mục đích xây dựng công thức bào chế thuốc. Công thức bào chế thuốc có chứa các thành phần hoạt hoạt chất có tác dụng dược lý mạnh (hoạt lực mạnh), cần phải có các chất độn hay pha loãng là một trong các vai trò của tá dược. Tính chất này cho phép thực hiện thuận tiện và chính xác phân tán thuốc (các hoạt chất) khi sản xuất một dạng bào chế. Tá dược cũng có thể ảnh hưởng tới khả năng giải phóng và hấp thu của dược chất trong cơ thể tức là ảnh hưởng đến đáp ứng lâm sàng của thuốc (các quá trình dược động học của thuốc trong cơ thể). Tá dược cũng có ích cho các quá trình sản xuất, pha chế thuốc như làm tăng độ hòa tan của thuốc, làm tăng tính chất trơn chảy của hạt thuốc (dập viên, đóng nang), tá dược còn đóng vai trò quan trọng trong độ ổn định của thuốc (dược chất, dạng bào chế) giúp thuốc đạt được tuổi thọ như mong muốn.
Dược chất: dược chất (còn gọi là hoạt chất) là chất hoặc hỗn hợp các chất dùng để sản xuất thuốc, có tác dụng dược lý hoặc có tác dụng trực tiếp trong phòng bệnh, chẩn đoán bệnh, chữa bệnh, Điều trị bệnh, giảm nhẹ bệnh, Điều chỉnh chức năng sinh lý cơ thể người.
Khảo sát nhiều loại cao xoa tại Việt Nam, hai thành phần thường bắt gặp nhất là menthol và methyl salicylate, hai chất này có trong tinh dầu Bạc Hà. Ngoài ra còn có khuynh diệp, quế, tràm, long não, hương nhu, thông, cineole,...tá dược như vaselin, novalin, paraffin,… (Nguyễn Ðức Ðoàn, 2002)
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) thu mua ở ấp Chợ, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp HCM.
Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Shigella boydii, Staphylococcus
aureus, Salmonella typhimurium.
Hình 2.1. Ngải cứu được sử dụng làm nguyên liệu trong nghiên cứu. a. Vườn Ngải cứu b. Nhánh Ngải cứu để héo 5 ngày
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Thiết bị:
Bộ chưng cất tinh dầu Clevenger Autoclave (Đức).
Cân phân tích, cân kỹ thuật.
Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức). Bếp điện
Máy xay khô Bể điều nhiệt Dụng cụ:
Bông thấm nước, bông không thấm nước. Pipetman 100 µl, 1000 µl.
Becher 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL Erlen 250 m.
Đĩa Petri
Que cấy tăm bông Đèn cồn
Ống đong. Pipette. Lọ thủy tinh. Đũa thủy tinh. Ống nghiệm. Phễu thủy tinh. Phễu chiết. Giấy lọc.
2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất để pha môi trường NA, NB Na2SO4 NaCl Nước cất KOH 0,1N HCl 0,1N Thuốc thử phenolphthalein
Ethanol 96o, ethanol 80o và ethanol 70o
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là: môi trường Nutrient agar và môi trường Nutrient Broth.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm với các nội dung:
Kích thước nguyên liệu
Thời gian để héo nguyên liệu
Tỷ lệ rắn/lỏng
Chỉ số hóa học tinh dầu Ngải cứu
Độ hòa tan trong ethanol Định lượng tinh
dầu Ngải cứu Tỷ trọng tinh dầu Ngải cứu
Salmonella typhimurium Staphylococcus
aureus
Nguyên liệu Ngải cứu
Xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn
hơi nước
Đánh giá cảm quan
Xác định chỉ tiêu hóa lý của tinh
dầu Ngải cứu
Xác định thành phần hóa học tinh dầu Ngải cứu bằng
phương pháp GC-MS Đánh giá hoạt lực kháng khuẩn Nồng độ dung dịch NaCl Thời gian ngâm nguyên liệu trong dung
dịch NaCl Thời gian chưng cất Màu sắc Mùi Vị Escherichia Coli Shigella boydii
Hình 2.3. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
2.2.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
Nguyên liệu (lá Ngải cứu)
+ Loại bỏ tạp chất
+ Cắt bỏ lá héo, già, bỏ rễ Ngâm trong dung dịch nước + NaCl
Ly trích bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
Hỗn hợp tinh dầu với nước
Bình lóng (phễu chiết)
Nước Tinh dầu thô (tinh dầu + nước)
Làm khan bằng Na2SO4
Tinh dầu Ngải cứu
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chưng cất và thu nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Thuyết minh quy trình:
Lắp đặt hệ thống chưng cất hơi nước và chưng trong khoảng từ 30’ đến 180 phút để lấy tinh dầu Ngải cứu ở dạng thô.
Sau quá trình chưng cất là quá trình lắng và làm sạch tinh dầu. Để cho việc tách tinh dầu ra dễ dàng, phân lớp rõ ràng của lớp nước và tinh dầu.
Sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng thì tiếp tục cho khoảng 5 g Na2SO4 khan để làm khan triệt để những hạt nước còn nằm trong lớp tinh dầu.
Lấy phần nước chưng còn lẫn ít tinh dầu trữ lại và đen chưng lại để thu tinh dầu triệt để hơn.
Thu tinh dầu đã được làm sạch và bảo quản.
Tính toán kết quả và so sánh lượng tịnh dầu của lá Ngải cứu. Đem tinh dầu Ngải cứu đi bảo quản và thử hoạt tính sinh học.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứuthu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Tiến hành khảo sát yếu tố: nguyên liệu tươi và để héo, 2 loại mẫu lá Ngải cứu (lá non, lá già), nguyên liệu để nguyên, cắt nhỏ và xay nhuyễn, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất và nồng độ muối.
Nguyên tắc: cố định 6 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó cố định yếu tố này và tiếp tục thay đổi một yếu tố khác, cứ tiến hành như vậy cho đến khi chọn được mức yếu tố tối ưu cho quá trình ly trích.
2.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định 6 yếu tố: nguyên liệu mẫu lá già, để héo, thời gian ngâm nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nồng độ muối. Sau đó tiến hành trích ly thu tinh dầu và so sánh để tìm ra được kích thước nguyên liệu tối ưu.
Nghiệm thức
A1
A2
A3
2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định các yếu tố: thời gian chưng cất, nồng độ muối, thời gian ngâm mẫu, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ, để héo và thay đổi 2 loại lá Ngải cứu: lá già và lá non. Sau khi ly trích, so sánh lượng tinh dầu thu được ở những thời gian khác nhau, từ đó chọn loại nguyên liệu lá Ngải cứu làm nguyên liệu trích ly tinh dầu Ngải cứu thích hợp.
Nghiệm thức
B1
2.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định thời gian chưng cất, thời gian ngâm mẫu, nguyên liệu lá già, để héo, lượng nước chưng cất, nguyên liệu được cắt nhỏ, ta thay đổi nồng độ dung dịch NaCl chưng cất như sau: 0% (0g/450mL nước cất), 5% (22,5 g/450 mL nước cất), 10% (45 g/450 mL nước cất), 15% (67,5 g/450 mL nước cất). Khi chưng cất, tinh dầu tạo với nước thành hệ nhũ tương, việc cho muối vào hỗn hợp chưng cất để tránh thất thoát tinh dầu dưới dạng nhũ, làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước. Đồng thời sẽ tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến tăng nhiệt độ sôi (tăng áp suất hơi) của nước. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối do khi ở nồng độ cao thì các lớp biểu bì ngoài chứa tinh dầu co lại, ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài. Nghiệm thức C1 C2 C3 C4
2.2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong dung dịch NaCl hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Thời gian ngâm nguyên liệu với dung dịch nước muối trước khi chưng cất có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích tinh dầu thu được. Do có thời gian để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường bên ngoài nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều ngay từ đầu và thể tích tăng đáng kể. Đồng thời muối sẽ làm tăng tỷ trọng của nước phá vỡ hệ nhũ tương tinh dầu – nước và tinh dầu bị hơi nước cuốn đi dễ dàng hơn khi chưng cất. Thời gian ngâm khảo sát 0 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, cố định các yếu tố đã tối ưu.
Nghiệm thức
D1
D2
D3
2.2.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Với các mức tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định các yếu tố còn lại và thay đổi các mức thời gian chưng cất như sau: 30 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút, 3 giờ, 3 giờ 30 phút, 4 giờ. Thời gian chưng cất càng lâu lượng tinh dầu thu được càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời điểm nào đó thì lượng tinh dầu thu được không tăng lên theo thời gian. Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn
ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của tinh dầu.
2.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Cố định các yếu tố đã tối ưu, nguyên liệu được làm héo ở 45 – 50οC ở các mức thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Sau đó tiến hành trích ly và so sánh lượng tinh dầu thu được để chọn ra độ héo tối ưu.
2.2.2.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Với các mức tối ưu của các yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất như sau: 300 mL, 450 mL và 600 mL. Ghi nhận lượng tinh dầu thu được ở mỗi nghiệm thức, từ đó xác định lượng nước chưng cất tối ưu. Tỷ lệ nguyên liệu/nước chưng ảnh hượng mạnh đến hiệu suất thu hồi tinh dầu. Lượng nước quá nhiều, một số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu.
2.2.3. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,...
Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu. Màu sắc và độ trong suốt:
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 mL, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
Mùi:
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ.
Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc,...). Vị:
Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng,…) và cường độ của vị (dịu, thoảng,…) (Tôn Long Dày, 2013)
2.2.3.1 Xác định chỉ số vật lý a. Định lượng tinh dầu
Theo (TCVN 8444:2010) hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức: %tinh dầu = số mL tinh dầu thu được sau chưng cất × 100% số gam nguyên liệu tươi hoặc khô
b. Tỷ trọng
Tỷ trọng của tinh dầu tại 20oC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20oC.
Do hàm lượng tinh dầu thu được ở mỗi lần chưng cất rất thấp, các phương pháp bảo quản chưa được tối ưu dẫn đến việc tinh dầu bị quang hóa, oxy hóa có thể ảnh hưởng đến kết quả đo tỷ trọng. Vì vậy việc sử dụng bình tỷ trọng 10 mL không phù hợp, thay vào đó việc đo tỷ trọng được thực hiện theo phương pháp thủ công.
Dùng một ống tiêm y tế (loại 1 mL), trên thân ống tiêm được vạch một đường làm dấu.
Cách xác định:
Tiếp theo: hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng khí), đem cân và ghi lại số liệu (m1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm, vẩy cho khô nước.
Cuối cùng: hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (m2).
Tỷ trọng d20 m 2 - m 0 20m1-m0 (TCVN 189:1993) Với:
m0: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng gam (g) m1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g) m2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g) Cứ như thế lặp lại nghiệm thức 3 lần: d(tb) = (d1 + d2 + d3)/3
c. Độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol
Pha ethanol 90o, 80o, 70o từ cồn tuyệt đối.
Dùng pipette chuẩn hút 1 mL tinh dầu Ngải cứu cho vào bình tam giác có nút mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 mL vào đậy nút và lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã dùng. Lặp lại thao tác 3 lần.
2.2.3.2. Xác định chỉ số hóa học Chỉ số acid (Index Acid)
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do có trong 1