2.2.4.1. Bước 1 (Lựa chọn người bệnh)
- Theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện.
- Đối tượng là các BN được chẩn đoán là BTTMCB mạn tính thỏa mãn tiêu chuẩn chẩn đoán và không có tiêu chuẩn loại trừ.
- BN tham gia nghiên cứu được giải thích đầy đủ về lợi ích của nghiên cứu, và được BN và người nhà đồng tình tham gia. Nghiên cứu không làm ảnh hưởng tới sức khỏe cũng như lợi ích của BN. Kết quả nghiên cứu thu được góp phần giúp năng cao chất lượng điều trị.
- Lập phiếu nghiên cứu, đăng ký nghiên cứu theo mẫu nhất định.
- Các đối tượng nghiên cứu được theo dõi theo mẫu thống nhất gồm các yếu tố nguy cơ suy tim, các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng. Thực hiện thông qua việc hỏi, khám bệnh để phát hiện các triệu chứng suy tim, triệu chứng của bệnh ĐMV, các bệnh liên quan nếu có và các yếu tố nguy cơ cũng như tiền sử bản thân và gia đình.
- Hỏi các yếu tố nguy cơ của bệnh tim mạch: tuổi, giới, chỉ số khối cơ thể (BMI), hút thuốc lá, uống rượu.
- Hỏi các triệu chứng cơ năng: đau ngực, hồi hộp đánh trống ngực khó thở, đau tức vùng gan, ho, phù, tiểu ít, ngất.
- Khám phát hiện các triệu chứng thực thể: tím môi và đầu chi, da và niêm mạc nhợt, phù, gan to, tĩnh mạch cổ nổi, phản hồi gan tĩnh mạch cổ, huyết áp, nghe tim (nhịp tim, tiếng bất thường có hay không), ran ở phổi.
- Đo các chỉ số nhân trắc: chiều cao và cân nặng đo bằng cân bàn, cân chính xác đến 0,5 kg và chiều cao chính xác đến 1 cm. Đối tượng mặc quần áo mỏng, không đi giày, dép.
- Tính BMI theo công thức của WHO: BMI = Cân nặng (Kg)
[Chiều cao(m)]2
- Làm các xét nghiệm cơ bản và các xét nghiệm đặc hiệu giúp cho chẩn đoán bệnh, điều trị và tiên lượng
+ Công thức máu: định lượng số lượng hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố, Hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạnh cầu, số lượng tiểu cầu.
+ Sinh hóa máu, định lượng các chỉ số: ure, creatinin, glucose, cholesterol, triglyceride, LDL-C, HDL-C, điện giải (Na+, K+,Cl-), HsTroponin.
+ Định lượng nồng độ NT-proBNP huyết tương lần 1 khi BN nhập
viện và lần 2 sau điều trị 7 ngày.
* Quy trình xét nghiệm NT-proBNP
Hunt và cộng sự là những người đầu tiên đưa ra phương pháp xét nghiệm định lượng NT-proBNP huyết thanh. Về sau, nhiều phương pháp định lượng khác được tìm ra và phát triển. Tất cả các phương pháp này đều dựa trên sự cạnh tranh trực tiếp của kháng thể. Hiện nay, xét nghiệm NT- proBNP huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch điện hóa quỳnh quang và phương tiện xét nghiệm hoàn toàn tự động được tìm ra và phát triển rộng rải. Kháng thể gắn trực tiếp vào vị trí acid amin 1-21 và 39-50 của phân tử NT- proBNP [43].
Phân tích sinh hoá của NT-proBNP được tiến hành bằng xét nghiệm miễn dịch điện hóa huỳnh quang ECLIA (Electrochemiluminescence immunoassay) trên máy Roche Elecsys 2010 và phân tích xét nghiệm miễn dịch bằng 10 MODULAR ANALYTICS E170. Phương pháp định lượng nồng độ NTproBNP huyết thanh của hãng Roche bằng cách dùng 2 kháng thể đa dòng để kết hợp kháng nguyên tại vị trí đã bộc lộ là 1-21 và 39-50. Một vị trí được đánh dấu với Biotin và vị trí khác được đánh dấu bằng phức hợp Ruthenium, để gắn với NT-proBNP hình thành phức bộ “kẹp”. Sự phát hiện được hỗ trợ bởi chất đánh dấu vi mảnh Streptavidin. Phức hợp này sau đó
được gắn kết thông qua phản ứng Biotin-Streptavidin. Mẫu máu 1 ml sau khi lấy từ BN được đựng vào ống nghiệm chứa sẵn K3-EDTA. Máu được quay ly tâm và tách huyết thanh, lưu trữ huyết thanh được 3 ngày ở nhiệt độ 2-80 C và 12 tháng khi được làm đông -20oC.Phản ứng chéo với kháng huyết thanh Aldosteron, ANP28, BNP32, CNP22, Endothelin, và Angiotensin I, Angiotensin II, Angiotensin III, Renin, NT-proANP là <0,001 %.Giới hạn phát hiện của xét nghiệm là 5 pg/ml [44].
Các xét nghiệm định lượng NT-proBNP huyết thanh không đồng nhất kết quả. Việc phát hiện đoạn NT-proBNP phụ thuộc chính vào kháng thể gắn kết và phương pháp xét nghiệm đặc hiệu. Vì vậy, giá trị nồng độ NT-proBNP huyết thanh cho kết quả khác nhau là điều tất nhiên [43].
Bảng 2.1. Các phương pháp định lượng NT-proBNP
Tác giả Phương pháp Trung vị (pmol/L)
Hughes Miễn dịch huỳnh quang 159 (120–245)
Schulz Miễn dịch phóng xạ 29 (13–75)
Mueller Miễn dịch men 78 (38–145)
Protera Miễn dịch điện hóa huỳnh quang
6,1 ± 4,1
* Nguồn: theo Hoàng Anh Tiến và cs (2006) [43]
Bảng 2.2. Giá trị NT-proBNP huyết tương ở người khỏe mạnh theo tuổi và giới
Tuổi 45-59 Tuổi ≥ 60 Nam Nữ Nam Nữ N Trung vị (ng/L) Trung bình (ng/L) Trung bình + 2SD (ng/L) Ngưỡng > 97,5% bách 134 20 28 82 100 144 49 61 145 164 51 40 53 143 172 60 78 86 195 225
phân vị (ng/L)
* Nguồn: theo Galasko G, và cộng sự (2005) [114]
• Nguyên lý
Bộ kit sử dụng để định lượng mức NT-proBNP trong mẫu thử. Sử dụng kháng thể tinh sạch NT-proBNP của người gắn phủ lên bề mặt các giếng của vi phiến tạo lớp kháng thể pha rắn. Sau đó cho mẫu chứa NT-proBNP cần định lượng vào các giếng, tiếp theo cho kháng thể kháng NT-proBNP có gắn các enzyme phản ứng tạo màu tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên - kháng thể gắn enzyme. Sau khi rửa sạch những thành phần không gắn đặc hiệu, cho chất nền tác dụng hóa học vào trong giếng, chất nền sẽ chuyển thành màu xanh dưới xúc tác của enzyme HRP, trong đó đậm độ màu sắc của giếng sẽ tương ứng với lượng NT-proBNPcó trong mẫu cần định lượng. Kết thúc phản ứng bằng cách cho thêm một lượng acid sulfuric vừa đủ, dung dịch trong giếng sẽ chuyển màu và tiến hành đo quang phổ ở bước sóng 450 nm (O.D.). Nồng độ NT-proBNPtrong các mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh O.D. của mẫu với đường chuẩn.
• Hiệu năng của bộ kit
1. Khoảng nồng độ định lượng: 0 – 800 pg/mL. Với nồng độ chất chuẩn cho xây dựng đường cong được sử dụng cho ELISA là: 800, 400, 200, 100, 50 và 0 pg/mL
2. Độ chính xác: Hệ số tương quan hồi quy tuyến tính tiêu chuẩn sử dụng để ngoại suy nồng độ chất thử, với giá R lớn hơn hoặc bằng 0.9900.
3. Độ nhạy: Nồng độ phát hiện tối thiểu cho NT-proBNP nhỏ hơn 1,0 pg/ml. 4. Độ đặc hiệu: Bộ kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho NT-proBNP. 5. Độ lặp lại: Intra-assay CV(%) < 10% ; Inter-assay CV (%) <15%.
Phản ứng chéo: Xét nghiệm này nhận biết NT-proBNP tái tổ hợp và tự nhiên. Không có khả năng phản ứng chéo giữa NT-proBNP và các chất tương tự. 6. Hạn sử dụng: 6 tháng kể từ ngày sản xuất.
7. Bảo quản: 2-8oC
• Chuẩn bị mẫu cho huyết tương
Mẫu máu được cho vào ống chống đông bằng EDTA, citrate hoặc heparin. Li tâm ở 3000 vòng trong 10 phút loại bỏ huyết tương. Tiến hành phá vỡ hồng cầu bằng cách cho 4 lần thể tích nước cất lạnh vào khối hồng cầu (pha loãng 5 lần), ly tâm ở 10000 vòng trong 10 phút thu dịch nổi, . Thực hiện kỹ thuật ngay sau đó hoặc lưu mẫu ở nhiệt độ - 80oC trong trường hợp chưa thực hiện kỹ thuật. Tránh lặp lại việc đông và rã đông mẫu xét nghiệm.
• Các thiết bị yêu cầu khác không đi kèm theo kit
1. Microplate reader: có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. 2. Pipettes và đầu tips có thể điều chỉnh ở mức 1ml đến 2ml.
3.Pipete đa kênh và đầu tip có thể điều chỉnh ở mức thể tích 50 μl đến 200 μl. 4. Pipette có thể điều chỉnh ở mức thể tích 10 ml đến 100 ml.
5. Chai chứa có thể tích 100ml và 1 lít. 6. Giấy thấm.
7. Máy ủ 37oC.
8. Nước cất hoặc nước khử ion.
9. Phần mềm vẽ đồ thị, hoặc đồ thị giấy sẵn.
10. Các tube để chuẩn bị cho pha loãng chuẩn và mẫu. • Các vật liệu được cung cấp trong kit
Bảng 2.3. Các vật liệu trong bộ kit
Hóa chất Thông số kỹ thuật
Đĩa vi phiến phủ kháng thể 96 giếng
Chất chuẩn Lọ 0.3 ml x 6
Dung dịch pha loãng mẫu Lọ 6 ml Enzyme liên hợp HPR Lọ 10 ml
Dung dịch rửa 20X Lọ 25 ml
Chất nền B Lọ 6 ml Dung dịch dừng phản ứng Lọ 6 ml
• Tóm tắt các bước của kỹ thuật ELISA trong định lượng NT-proBNP 1. Các bước chuẩn bị mẫu, chuẩn bị thuốc thử và các bước tiến hành của kỹ thuật được tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2. Cho 50 l mỗi nồng độ chuẩn vào hai giếng đã quy trịnh trên vi phiến. 3. Quy định giếng trắng trên đĩa vi phiến (giếng này sẽ không cho mẫu và enzyme liên hợp, các bước còn lại tương tự như các giếng khác). Cho mẫu vào các giếng cụ thể như sau: cho 40 l của dung dịch pha loãng mẫu và 10 l thể tích mẫu vào trong giếng (mẫu được pha loãng 5 lần). Không được chạm vào thành và đáy giếng trong quá trình tra mẫu. Sau đó lắc nhẹ nhàng. 4. Cho 100 l enzyme liên hợp HPR vào các giếng ngoại trừ giếng trắng. Sau khi dán đĩa vi phiến bằng tấm màng cung cấp theo kit, tiến hành ủ ở 37oC trong 30 phút.
5. Loại bỏ dịch trong các giếng, tiến hành rửa 5 lần. Ở lần rửa cuối cùng tiến hành úp đĩa vi phiến lên giấy thấm hoặc khăn giấy để loại bỏ hoàn toàn dịch còn đọng lại trong giếng.
6. Phản ứng tạo màu: cho 50 l chất nền A và B vào trong các giếng. Lắc nhẹ nhàng phủ kín và ủ ở ở 37oC trong 15 phút trong tối.
7. Cho 50 l dung dịch dừng phản ứng và mỗi đĩa và lắc đều. Màu sẽ chuyển từ xanh sang vàng.
8. Tiến hành đọc kết quả bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 450 nm, đọc kết quả trong vòng 15 phút.
• Tính kết quả
Vẽ đường chuẩn trên đồ thị giấy với trục hoành là nồng độ chuẩn, trục tung là giá trị O.D. của chuẩn. Từ đó quy ra nồng độ NT-proBNP tương ứng theo giá trị O.D. của các mẫu cần xác định dựa vào đường cong chuẩn sau đó nhân với hệ số pha loãng của mẫu để ra nồng độ cuối cùng. Hoặc có tính
thông qua phương trình đường cong hồi quy tuyến tính dựa trên các số liệu từ mẫu chuẩn, thông qua phần mềm chuyên dụng.
- Chụp Xquang tim phổi: đo chỉ số tim/lồng ngực, đánh giá ứ huyết phổi, tràn dịch màng phổi.
- Ghi ĐTĐ 12 đạo trình bằng máy NIHON KOHDEN – Cardiofax S:
+ Thời điểm ghi ĐTĐ 12 đạo trình: lúc BN vào khoa tim mạch, đã được nghỉ ngơi 10-15 phút.
+ Các chỉ số phân tích trên ĐTĐ 12 đạo trình: Tần số tim.
Các rối loạn nhịp tim.
Phân tích các biểu hiện thiếu máu cơ tim trên ĐTĐ.
- Siêu âm tim: Các bước siêu âm tim và đánh giá tình trạng các van tim, vận động thành tim, kích thước các buồng tim, chức năng tâm thu thất trái, chức năng tâm trương thất trái, áp lực động mạch phổi theo hướng dẫn của Hội siêu âm tim của Hoa Kỳ -2005 [115].
+ Đo kích thước các buồng tim. Đánh giá hình thái và chức năng thất trái
+ Đo phân số tống máu thất trái theo phương pháp Simpson’s + Quan sát rối loạn vận động các thành tim.
- Ghi Holter ĐTĐ 24 giờ lần 1 (trước điều trị)
+ Phương tiện: Hệ thống máy ghi ĐTĐ liên tục theo phương pháp Holter (máy Rozinn của Hoa Kỳ). Bao gồm dây dẫn, điện cực, đầu ghi ĐTĐ 24 giờ, pin AA 1,5 vôn, máy tính được cài phần mềm có khả năng xử lí và phân tính các số liệu thu được, máy in Laser.
Hình 2.1. Hệ thống máy Holter Điện tâm đồ của hãng Rozinn
+ Cách đặt điện cực
Bảng 2.4. Vị trí các chuyển đạo Holter Điện tâm đồ
Chuyển đạo Kênh Màu AHA Vị trí
mV5 (-) CH1 (-) Trắng Đòn phải cạnh ức
mV5(+) CH1(+) Đỏ Xương sườn 6 đường nách trước mV1(-) CH2(-) Đen Đòn trái cạnh ức
mV1(+) CH2(+) Nâu Gian sườn 6 cạnh ức (P) DIII(-) CH3(-) Xanh lam Giữa đầu trên xương ức
DIII(+) CH3(+) Cam Xương sườn 6 đường giữa đòn (T) Trung gian Xanh lục Thành ngực phải, thấp
Hệ thống Holter của chúng tôi sử dụng phương pháp ghi 3 kênh V5, V1 và DIII sửa đổi (CH1-mV5, CH2-mV1, DIII).
Hình 2.2. Sơ đồ mắc điện cực Holter Điện tâm đồ * Quy trình đặt máy theo dõi Holter Điện tâm đồ
. BN không dùng các thuốc digoxin, dopamin, dobutamin, cordarone.
. Giải thích cho BN và người nhà mục đích, yêu cầu, cách thức ghi Holter ĐTĐ. . Chuẩn bị máy ghi Holter ĐTĐ, lắp pin.
. Chuẩn bị da vùng đặt điện cực ĐTĐ: tại vùng đặt điện cực được lau sạch da bằng cồn và bôi gel dùng cho ghi ĐTĐ.
. Dán điện cực trên da.
. Kết nối điện cực với máy ghi Holter, cố định dây dẫn và điện cực sao cho tránh bị xoắn vặn và căng dây gây nên tuột, lỏng điện cực trong quá trình theo dõi. . Ghi Holter ĐTĐ trong 24 giờ.
. Tháo máy sau 24 giờ, nạp dữ liệu vào máy tính.
+ Phân tích Holter ĐTĐ được thực hiện bởi bác sỹ chuyên khoa tim mạch. Các thông số bao gồm:
. Tần số tim trung bình, tần số tim nhanh nhất, tần số tim chậm nhất. . Rối loạn nhịp trên thất, số lượng và tỉ lệ ngoại tâm thu trên thất.
. Rối loạn nhịp thất, số lượng và tỉ lệ ngoại tâm thu thất, tính chất rối loạn nhịp thất theo phân độ của Lown.
+ Các chỉ số BTNT theo thời gian (đơn vị mili giây): đặc trưng cho trương lực hoạt động thần kinh phó giao cảm.
. SDNN: Độ lệch chuẩn của tất cả các thời khoảng R-R bình thường trên toàn bộ Holter điện tim 24 giờ. Giảm khi SDNN < 50ms, phản ánh mất nhịp sinh học, giảm tác động của hệ TKTC lên nhịp tim.
. SDANN: Độ lệch chuẩn của số trung bình của tất cả các thời khoảng R-R bình thường trên toàn bộ các đoạn 5 phút của Holter ĐTĐ 24 giờ.
. rMSSD: Căn bậc hai số trung bình của bình phương sự khác biệt giữ các thời khoảng R-R bình thường kề nhau của Holter điện tim 24 giờ. Giá trị này phản ánh chức năng TKPGC. Giảm khi rMSSD < 15ms.
. SDNNi: Trung bình của độ lệch chuẩn của tất cả các thời khoảng R-R bình thường trên toàn bộ các đoạn 5 phút của Holter ĐTĐ 24 giờ. Giảm khi SDNNi < 30ms.
. pNN50 (%): Phần trăm khác biệt giữa các thời khoảng R-R bình thường sát nhau lớn hơn 50ms tính trên toàn bộ Holter ĐTĐ 24 giờ. Giá trị này phản ánh chức năng thần kinh phó giao cảm. Giảm khi pNN50 <0,75.
+ Các chỉ số BTNT phân tích phổ tần số (đơn vị ms2) . TP: Tổng độ lớn của BTNT theo phổ tần số, từ 0-0,4 Hz. . ULF: BTNT ở dải tần số cực thấp (0 đến <0,003Hz). . VLF: BTNT ở dải tần số rất thấp (0, 003- 0,04Hz).
. LF: Vùng tần số thấp (0,04-0,15Hz), khi tăng LF thường tăng hoạt động của thần kinh giao cảm.
. HF: Vùng tần số cao (0,15-0,40Hz), khi tăng HF thường tăng hoạt động của thần kinh phó giao cảm.
. Tỷ số LF/HF: đánh giá cân bằng hoạt động của thần kinh giao cảm và phó giao cảm.
Bảng 2.5. Giá trị một số chỉ số biến thiên nhịp tim của người bình thường Chỉ số BTNT Giá trị SDNN (ms) 122.89 ± 3,92 SDNNi (ms) 110,26 ± 3,59 rMSSD (ms) 37,15 ± 2,30 HF (ms2) 207,38 ± 23,24 LF (ms2) 155,29 ± 32,05 VLF (ms2) 141,93 ± 32,25 ULF (ms2) 15,52 ± 1,23 TF (ms2) 2029,69 ± 309,04
* Nguồn: Huỳnh Văn Minh và cs (2007) [116]
+ Các biến đổi của đoạn ST, sóng T.
- Làm các test gắng sức (ĐTĐ, siêu âm tim gắng sức) với BN nguy cơ thấp và trung bình.
- Tiến hành chụp MSCT ĐMV hoặc chụp ĐMV qua da với NB nguy cơ cao. Chỉ định ĐMV vành qua da dựa theo hướng dẫn về chẩn đoán BTTMCB mạn của Hội Tim mạch Việt Nam và Hội Tim mạch Châu Âu.
* Quy trình chụp ĐMV qua da.
+ Giải thích cho bệnh nhân và gia đình BN về lợi ích, nguy cơ, chi phí của thủ thuật chụp ĐMV. Cho người nhà ký giấy cam đoan làm thủ thuật.