- Đối với nhóm phụ nữ không nhiễm HPV: chúng tôi chọn mẫu theo phương pháp bắt cặp được 140 phụ nữ từ danh sách hồi cứu năm 2013:
9) Ung thư tế bào biểu mô tuyến tại chỗ (AIS)
2.2.5 Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu 1 Phương tiện nghiên cứu
2.2.5.1 Phương tiện nghiên cứu
* Bộ câu hỏi phỏng vấn đối tượng theo các nội dung nghiên cứu
Sử dụng 3 bộ câu hỏi soạn sẵn để tiến hành thu thập thông tin về đặc điểm chung, tình trạng nhiễm HPV, kết quả xét nghiệm PAP của phụ nữ ở các giai đoạn nghiên cứu, sự biến đổi kết quả HPV-DNA, PAP, VIA, mô bệnh học
và các yếu tố liên quan đến sự biến đổi HPV-DNA và tế bào học cổ tử cung của đối tượng nghiên cứu, cụ thể:
-Bộ câu hỏi 1 và 2: thu thập thông tin đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu thực hiện năm 2018 và năm 2020 (tham khảo phụ lục 1 và 2).
- Bộ câu hỏi 3: thu thập thông tin đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2,
* Dụng cụ, hóa chất, máy móc dùng cho xét nghiệm Realtime - PCR định tính (HPV-DNA) và định type HPV nhiễm ở đối tượng nghiên cứu
- Tube 0,2ml; 1,5ml; các loại đầu cone vàng, xanh, nồi khử trùng, tủ lạnh
- 200C, thùng đá nhỏ, gant tay vô trùng.
- Bộ micropipette 10, 100 và 1000µl
- Máy ly tâm eppendorf 5417C, Máy vortex, tủ ủ
- Tủ NunreTM Biological Satify cabiners class II - Máy Real-time PCR 5 màu CFX 96 của Bio-Rad
- Bộ hóa chất tách chiết DNA: DNA-Sorb-A/100 của hãng Sacace (Ý)
- Bộ hóa chất HPV High Risk Screen Real-TM của hãng Sacace (Ý)
- Bộ hóa chất HPV Genotype Plus Real-TM của hãng Sacace (Ý)
* Dụng cụ, hóa chất sử dụng cho xét nghiệm pap’smear
- Phiến kính có dán nhãn tên, tuổi và số mã của bệnh nhân.
- Mỏ vịt, pince dài
-Que gỗ (Spatule d’Ayre) hoặc Cytobrush để lấy bệnh phẩm.
- Dung dịch cồn 950
- Nước muối sinh lý 0,9%
- Thuốc nhuộm Giemsa.
- Kính hiển vi quang học.
* Dụng cụ, hóa chất sử dụng trong VIA
-Nước muối sinh lý 0,9% để thấm ướt bông lau dịch và chất nhày CTC.
- Acide acetic 3%.
* Dụng cụ, hóa chất để sinh thiết cổ tử cung và xét nghiệm mô bệnh học
- Lọ đựng bệnh phẩm (ghi họ tên bệnh nhân, tuổi, số bệnh phẩm). - Kẹp Pozzi.
- Kềm sinh thiết cổ tử cung.
- Dung dịch formol 10%.
- Oxy già.
- Khuôn đúc nến bệnh phẩm, dao cắt bệnh phẩm. - Hóa chất nhuộm mẫu bệnh phẩm.
- Kính hiển vi quang học đọc kết quả giải phẫu bệnh 2.2.5.2 Các bước tiến hành nghiên
cứu * Chuẩn bị
- Liên hệ Sở Y Tế, các trung tâm y tế hoặc phòng y tế của các quận, huyện của thành phố Cần Thơ có đối tượng tham gia nghiên cứu để hoàn chỉnh thủ tục pháp lý cho phép thực hiện nghiên cứu.
- Liên hệ các trạm y tế xã, phường thuộc các quận, huyện của thành phố Cần Thơ xây dựng kế hoạch phối hợp thực hiện và hỗ trợ liên lạc với các đối tượng nghiên cứu được chọn.
- Gửi thư mời hoặc điện thoại trực tiếp mời các phụ nữ đến khám sàng lọc tại trạm y tế địa phương theo lịch hẹn.
* Các bước tiến hành cụ thể ở hai thời điểm nghiên cứu
- Bước 1: chọn đối tượng nghiên cứu
+ Dựa trên danh sách phụ nữ tham gia nghiên cứu vào năm 2013. Trong 1.490 phụ nữ đại diện cho 9 quận, huyện thành phố cần Thơ, có 99 phụ nữ có kết quả HPV-DNA dương tính và 1.391 phụ nữ có kết quả HPV-DNA âm tính.
+ Chọn toàn bộ những phụ nữ có kết quả HPV-DNA dương tính. Tuy nhiên, sau khi liên lạc, chúng tôi chỉ ghi nhận được 73 phụ nữ còn sinh sống tại thành phố Cần Thơ và đồng ý tham gia nghiên cứu. Chúng tôi chọn toàn bộ số phụ nữ này đưa vào nghiên cứu cho nhóm phụ nữ nhiễm HPV.
+ Tương ứng với 73 phụ nữ nhiễm HPV này, chúng tôi chọn mẫu bắt cặp theo nơi cư trú và độ tuổi của phụ nữ được 140 phụ nữ không nhiễm HPV từ danh sách những phụ nữ đã tham gia nghiên cứu năm 2013 đưa vào nghiên cứu cho nhóm phụ nữ không nhiễm HPV.
- Bước 2: thu thập số liệu hồi cứu
Trên số đối tượng nghiên cứu đã chọn được, chúng tôi đồng thời cũng hồi cứu lại về kết quả xét nghiệm PAP (bình thường và bất thường), VIA (bình thường và bất thường) của các phụ nữ này.
- Bước 3: tiến hành thu thập số liệu nghiên cứu, bao gồm:
+ Phỏng vấn trực tiếp các đối tượng nghiên cứu bằng bộ câu hỏi soạn sẵn (phụ lục 2).
+ Tiến hành khám phụ khoa, chẩn đoán lâm sàng và điều trị cho các tổn thương tại cổ tử cung (nếu có).
- Bước 4: lấy các mẫu bệnh phẩm để làm các xét nghiệm HPV-DNA, PAP, VIA và làm mô bệnh học những phụ nữ có kết quả khám lâm sàng nghi ngờ tổn thương tế bào cổ tử cung.
Kỹ thuật lấy mẫu HPV: người phụ nữ nằm tư thế sản phụ khoa, được bộc lộ cổ tử cung bằng mỏ vịt, đưa que tăm bông vô trùng vào CTC ấn nhẹ và xoay tăm bông theo chiều kim đồng hồ 5 lần, sau đó rút que tăm bông ra khỏi cổ tử cung và âm đạo, nhúng que tăm bông vào ngay trong dung dịch bảo quản càng nhanh càng tốt, đậy nắp lọ bằng cách xoáy nắp chặt. Khi lấy bệnh phẩm dùng que tăm bông quay nhẹ nhàng theo chiều kim đồng hồ để tránh làm tổn thương niêm mạc cổ tử cung gây chảy máu, nếu lẫn nhiều hồng cầu sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình thực hiện các bước tiếp theo và kết quả xét nghiệm. Mẫu bệnh phẩm sẽ được trữ lạnh ngay và gửi đến phòng
Sinh học phân tử, trường Đại học Y Dược Cần Thơ không quá 6 giờ sau khi lấy. Kỹ thuật lấy mẫu PAP: tất cả các phụ nữ tham gia nghiên cứu được làm phết tế bào CTC bằng que Spatule với kỹ thuật lấy mẫu 1 lam: dùng đầu ngắn của spatula cào toàn bộ chu vi cổ ngoài cổ tử cung (xoay spatula 3600). Bắt đầu cào ở vị trí 9 giờ, xoay 1 vòng theo chiều kim đồng hồ, kết thúc ở vị trí 9 giờ (có thể xoay vòng
ngược chiều kim đồng hồ, từ vị trí 3 giờ đến 3 giờ). Rút spatula ra không phết tế bào lên lam. Sau đó, dùng đầu dài của spatula cào toàn bộ chu vi cổ trong cổ tử cung (xoay spatula 3600). Bắt đầu cào ở vị trí 9 giờ, xoay 1 vòng theo chiều kim đồng hồ, kết thúc ở vị trí 9 giờ. Nhanh chóng phết tế bào trên đầu ngắn spatula lên một nửa
lam ở kế bên phần kính mờ. Phết theo 1 chiều duy nhất, mỏng đều, đảm bảo chỉ có 1 lớp tế bào. Tiếp tục phết tế bào trên đầu dài của spatula lên một nửa lam phía đối diện với phần kính mờ. Phết theo 1 chiều duy nhất, mỏng đều, sao cho chỉ có 1 lớp tế bào. Cố định mẫu ngay lập tức bằng dung dịch cồn 95°.
Kỹ thuật làm VIA: VIA là phương pháp quan sát bằng mắt thường màu sắc của cổ tử cung (biểu mô lát và biểu mô tuyến) thời gian trong 1 - 2 phút sau khi bôi
acid acetic 3% lên bề mặt cổ tử cung. Làm xét nghiệm VIA bằng cách dùng bông gòn vô trùng lau sạch khí hư ở bề mặt CTC và túi cùng âm đạo, sau đó dùng bông nhúng acid acetic 3% bôi lên bề mặt CTC 1 phút và quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng đèn khám phụ khoa trong 1 phút mọi thay đổi ở cổ tử cung và vùng chuyển tiếp. Những trường hợp không rõ tổn thương hoặc nghi ngờ thì được đối chiếu với các kết quả bất thường qua chẩn đoán lâm sàng ở CTC như viêm lộ tuyến CTC, viêm CTC, tái tạo nang Naboth, polyp CTC, loét trợt, nghi ngờ ung thư và tiếp tục bôi acid acetic 3% lên bề mặt CTC và đánh giá lại kết quả.
Kỹ thuật sinh thiết cổ tử cung: tiến hành bấm sinh thiết cổ tử cung làm xét nghiệm mô bệnh học tất cả những phụ nữ nghiên cứu có kết quả VIA dương tính
và những trường hợp có kết quả PAP bất thường (PAP có kiểu hình ≥ AS-CUS).
Bấm sinh thiết tại vị trí VIA dương tính hoặc ở 4 vị trí 3, 6, 9, 12 giờ ở cổ tử cung nếu kết quả PAP bất thường bằng kềm sinh thiết chuyên dụng. Mẫu mô được bấm có kích thước từ 1 - 2mm lấy cả chiều dài của biểu mô và tổ chức đệm ở dưới. Sau đó, mẫu sinh thiết được cố định trong dung dịch formol 10%.
- Bước 5: gửi mẫu bệnh phẩm đến các phòng xét nghiệm để thực hiện xét nghiệm HPV-DNA lần 2, PAP lần 2, mô bệnh học lần 1:
+ Xét nghiệm HPV-DNA và định type HPV: được thực hiện tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh lý bệnh – miễn dịch, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ tiến hành thực hiện kỹ thuật realtime-PCR (Polymerase chain reaction), sử dụng bộ KIT High Risk Typing Real-TM của hãng Sacace – Italy sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001:2008& 13485:2004, đạt chuẩn: CE, IVD do công ty Việt Huy cung cấp để định tính (có nhiễm hay không nhiễm HPV) và xác định type
HPV (thông qua có hay không có sự xuất hiện tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu cho 14 types của HPV thuộc nhóm type nguy cơ cao gồm các type HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68). Ghi nhận các kết quả như sau:
+ Âm tính: nếu tín hiệu huỳnh quang chỉ hiện diện kênh Cy5 (kênh màu
Internal Contral).
+ Dương tính: nếu tín hiệu huỳnh quang hiện diện một hoặc kênh màu Fam,
Joe/Hex, Rox và Cy5 tương ứng với 14 type HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 66 và 68.
Cụ thể như sau:
+ Trên kênh FAM/ Green: phát hiện type HPV 16, 39, 33, 58.
+ Trên kênh JOE/ Yellow / HEX: phát hiện type HPV 31, 45, 35, 52. + Trên kênh ROX/ Orange: phát hiện type HPV 18, 59, 68, 66.
+ Trên kênh Cy5/ Red: phát hiện type HPV 56 và 51.
Bảng 2.1 Bảng phân tích kết quả HPV theo chương trình Microsoft ® Excel “HPV Genotype 14 Real- TM.xls (Nguồn: Sacace™ HPV Genotypes 14 Real-
TM Quant)
Ngày Mẫu Mạ trận so sánh Kết quả Ct phản ứng
Bảng 2.2 Bảng kết quả type HPV dựa vào 4 kênh màu (Nguồn: Sacace™ HPV Genotypes 14 Real-TM Quant)
- Xét nghiệm PAP: thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. Tiêu bản được nhuộm theo phương pháp Papanicolaou.
Kết quả được đọc bởi 01 bác sĩ chuyên khoa giải phẫu bệnh có kinh nghiệm, phân loại kết quả PAP theo hệ thống Bethesda 2014 bao gồm:
+ Không có tổn thương trong biểu mô hoặc ác tính: các thay đổi không tăng sinh và tế bào biến đổi do viêm.
+ Khác: tế bào nội mạc ở phụ nữ ≥ 45 tuổi
+ Bất thường tế bào biểu mô: gồm các thay đổi tế bào biểu mô lát và các thay đổi tế bào biểu mô tuyến.
Nhóm tế bào biểu mô thay đổi không điển hình bao gồm tế bào biểu mô
lát không điển hình (ASC-US, ASC-H) và nhóm tế bào biểu mô tuyến thay đổi không điển hình (AGC).
Tổn thương tế bào trong biểu mô lát mức độ thấp (LSIL) bao gồm loạn sản nhẹ/ CIN I; tổn thương tế bào trong biểu mô lát mức độ cao (HSIL) bao gồm loạn sản trung bình và nặng, CIS, CIN II và CIN III; ung thư tế bào biểu mô lát, ung thư tế bào biểu mô tuyến; ung thư tuyến nội mạc tử cung.
Ghi nhận kết quả PAP bình thường gồm những trường hợp tế bào biểu mô
bình thường hay tế bào biểu mô biến đổi do viêm nhiễm và kết quả bất thường gồm những trường hợp các thay đổi tế bào biểu mô lát và các thay đổi tế bào biểu
- Xét nghiệm giải phẫu bệnh: là xét nghiệm đánh giá tổn thương mô bệnh học tế bào biểu mô cổ tử cung trên mẫu mô sinh thiết cổ tử cung. Xét nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. Kết quả mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để đánh giá các tổn thương tiền ung thư, ung thư cổ tử cung của nhóm nghiên cứu. Mẫu sinh thiết mô bệnh học cổ tử cung được phân loại theo Richard năm 1980 (WHO 1980) bao gồm:
+ Tế bào biểu mô bình thường
+ Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung độ I (CIN I)
+ Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung độ II (CIN II) + Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung độ III (CIN III) + Ung thư biểu mô lát xâm lấn
+ Ung thư biểu mô tuyến
+ Ung thư biểu mô không biệt hóa.
- Bước 6: Ghi nhận kết quả
Ghi nhận kết quả xét nghiệm từ các phòng xét nghiệm. Sau đó, đối chiếu so sánh với kết quả xét nghiệm năm 2013 để tính ra tỷ lệ biến đổi của từng loại xétnghiệm HPV-DNA, PAP, VIA theo chiều hướng tốt và chiều hướng xấu hoặc là không có sự biến đổi.
Những trường hợp có kết quả bất thường sẽ được tư vấn điều trị cụ thể, và hướng dẫn đến bệnh viện chuyên khoa theo dõi điều trị nếu có chỉ định:
+ Những trường hợp phụ nữ có kết quả HPV dương tính, VIA dương tính, PAP bất thường từ ASC-US đến HSIL, CIN I đến CIN II: tư vấn về cách
nâng cao sức khỏe về chế độ dinh dưỡng, thói quen sinh hoạt, đời sống tình dục lành mạnh, khám và điều trị bệnh phụ khoa định kỳ mỗi 6 tháng hoặc khi có triệu chứng bất thường.
+ Những trường hợp phụ nữ có kết quả PAP ung thư cổ tử cung hoặc mô bệnh học từ CIN III trở lên sẽ được hướng dẫn đến bệnh viện ung bướu thành phố Cần Thơ hoặc Bệnh viện Từ Dũ điều trị.
Chọn ngẫu nghiên 5 mẫu bệnh phẩm cho mỗi loại xét nghiệm PAP, HPV-DNA và giải phẫu bệnh, gửi kiểm chứng tại các khoa xét nghiệm tương ứng của Bệnh viện Chợ Rẫy để so sánh, đánh giá độ chính xác, tin cậy của các kết quả xét nghiệm. Kết quả kiểm chứng cho thấy kết quả xét nghiệm PAP, HPV-DNA, MBH ở 2 nơi có
độ tương đồng khá cao. Điều này cho thấy, các kết quả số liệu thu thập trong nghiên cứu của chúng tôi là chính xác và đáng tin cậy.
@ Năm 2020:
- Bước 8: tiến hành các bước thu thập số liệu như ở năm 2018 bằng bộ câu hỏi soạn sẵn (phụ lục 3).
- Bước 9: tổng hợp các thông tin và số liệu thu thập được từ các bộ câu hỏi 1, 2, 3 và các kết quả xét nghiệm ở các thời điểm 2013, 2018 và 2020 để xác định sự biến đổi HPV-DNA, biến đổi tế bào học cổ tử cung và mối liên quan đến các sự biến đổi này, cũng như nguy cơ giữa các biến đổi này với một số yếu tố đã được khảo sát, từ đó đưa ra kết luận về vấn đề nghiên cứu của luận án.