2. 3 Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 2
3.3.2.Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2
Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2
Số đợt TN Số cọng rạ Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 7 70 365 71,72 ± 3,10% (262 trứng) 65,31 ± 2,69% (172 trứng) 47,16 ± 3,61% α<0,05
Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chưa chín được bảo quản theo PP2
Sau 7 đạt thí nghiệm, đã tiến hành đông lạnh đƣợc 365 trứng nhƣng chỉ thu đƣợc 262 sau rã đông đạt tỷ lệ 71,72% ± 3,10 . Kết quả này cũng thấp hơn một số công trình đã công bố ở nƣớc ngoài: Abdel Mohsen M. Hammam và cs. (2005; 83,33%); Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 99,30%). Qua đây, ta thấy tỷ lệ trứng thất thoát trong quá trình giải đông tới 28,28% (Biểu đồ 3.14).
Qua quá trình tiến hành thủy tinh hóa trứng trong cọng rạ, chúng tôi nhận thấy trứng mất chủ yếu ở giai đoạn rã đông: ngay khi lấy cọng rạ ra khỏi bình nitơ lỏng, một số cọng rạ thƣờng bị nổ do thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột. Lúc đó, toàn bộ trứng trong cọng rạ không thể thu hồi đƣợc. Ngoài ra, khi cắt cọng rạ để chuyển môi trƣờng chứa trứng ra đĩa thu thƣờng có hiện tƣợng bọt khí tạo ra rất nhiều, chính yếu tố này làm cản trở phần nào việc tìm và thu nhận trứng. Đây là khó khăn về kỹ thuật mà chúng tôi cần khắc phục.
Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2
Trứng sống sau rã đông qua các đạt thí nghiệm là 172/262 trứng, đạt tỷ lệ 65,31% ±2,69 ; kết quả này cũng thấp hơn công bố của Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 98,9%); Dong-Hoon Kim và cs. (2007; 84%). Cũng tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt, số trứng chết nhiều sau đông lạnh ở phƣơng pháp này (34,69%) do một số nguyên nhân: chất lƣợng trứng không tốt, kỹ thuật tiến hành chƣa chuẩn, môi trƣờng chƣa đạt yêu cầu về các thông số pH, nồng độ
3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành theo 2 phương pháp thủy tinh hóa
Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành
Phƣơng pháp thủy tinh hóa
Sổ trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL PP1 477 74,34 ± 1,83% 71,92 ± 2,20% 53,70 ± 2,80% PP2 365 71,72 ± 3,10% 65,31 ± 2,69% 47,16 ± 3,61% Mức ý nghĩa α > 0,05 α > 0,05 α > 0,05
Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành
Kết quả Bảng 3.11. và Biểu đồ 3.16 cho thấy thấy:
- Tỷ lệ trứng thu đƣợc sau rã đông giữa hai phƣơng pháp không có sự khác biệt về thống kê (P > 0,05). Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp đều có nguy cơ mất trứng sau rã đông nhƣ nhau. Nguyên nhân gây mất trứng ở mỗi phƣơng pháp đã đƣợc phân tích ở phần trên.
- Tỷ lệ trứng sống sau rã đông ở hai phƣơng pháp có khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05). Điều này chứng tỏ thủy tinh hóa trong vi giọt có tỷ lệ trứng sống sau rã đông cao hơn thủy tinh hóa trong cọng rạ. Kết quả chúng tôi thu đƣợc phù hợp với lý thuyết: đông lạnh vi giọt có tốc độ làm lạnh cực nhanh do môi trƣờng chứa trứng tiếp xúc trực tiếp với LN2, sự thủy tinh hóa diễn ra hoàn toàn nên tránh hình thành tinh thể đá nội và ngoại bào gây tổn thƣơng đến trứng. Trong khi đó, cọng rạ giữ trứng đã tạo một lớp cách nhiệt khi nhúng mẫu vào LN2, giảm phần nào tốc độ làm lạnh mẫu, sự thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn gây ảnh hƣởng đến trứng nhiều hơn [Dinnyes, 2006].
3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ
Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau
Giai đoạn trứng đem ĐL Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL Chín 197 84,43 ± 1,84% 79,90 ± 2,33% 67,73 ±3,18% Chƣa chín 365 71,72 ±3,10% 65,31 ±2,69% 47,16 ±3,61% Mức ý nghĩa α < 0,05 α < 0,05 α < 0,05
Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau
Từ Bảng 3.12 và Biểu đồ 3.17 cho thấy việc bảo quản trứng bò đã đƣợc IVM cho kết quả tốt hơn trứng bò ở giai đoạn túi mầm (chƣa chín), tất cả sự khác biệt này đều có ý nghĩa về mặt thống kê (α < 0,05). Theo báo cáo của các nghiên cứu trên thế giới cho rằng bảo quản trứng ở giai đoạn túi mầm sẽ hạn chế sự tổn thƣơng về thoi vô sắc của trứng, từ đó làm tăng khả năng sống của trứng về sau. Nhƣ vậy, kết quả của chúng tôi thu đƣợc chƣa cao nhƣ các nghiên cứu của thể giới, song điều này đã khẳng định đƣợc phần nào sự thành công bƣớc đầu trong lĩnh vực bảo quản trứng ở cả hai giai đoạn. Tuy nhiên, cần tiến hành khảo sát
thêm các protocol bảo quản khác để chọn ra đƣợc protocol hiệu quả nhất trong điều kiện cho phép.
3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò và heo đã trưởng thành bằng PP2
Bảng 3.13. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trưởng thành bằng PP2
Đối tƣợng TN Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL Trứng bò 197 84,43 ± 1,84% 79,90 ± 2,33% 67,73 ±3,18% Trứng heo 386 80,70 ± 1,55% 47,54 ± 0,60% 38,39 ± 1,02% Mức ý nghĩa α > 0,05 α < 0,05 α < 0,05
Biểu đồ 3.18. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trưởng thành bằng PP2
Từ Bảng 3.13 và Biểu đồ 3.18 cho thấy tỷ lệ thu hồi trứng bò, heo ở giai đoạn trƣởng thành sau khi đƣợc bảo quản bằng PP2 là nhƣ nhau, tức là không có sự khác biệt về mặt thống kê (α > 0,05). Tỷ lệ trứng sống sau giải đông so với số lƣợng trứng thu hồi cũng nhƣ tổng số trứng đem đông lạnh đối với trứng bò cao hơn trứng heo rất nhiều, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (α > 0,05). Điều này có thể nói lên rằng quy trình đông lạnh này thích hợp cho việc bảo quản trứng bò hơn là bảo quản trứng heo. Vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu tìm ra quy trình bảo quản trứng heo hiệu quả hơn.
CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ mục tiêu đặt ra, đề tài đã đạt đƣợc một số kết quả sau: 1.Trứng heo
• Đã thu và nuôi đƣợc 1189 trứng, tỷ lệ trứng trƣờng thành 65,42 ± 0,79 %.
• Bảo quản 305 trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt, tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 46,15 ± 5,63 % (91 trứng).
• Bảo quản 386 trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong 71 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 47,54 ± 0,60 % (149 trứng).
2. Trứng bò đã IVM
• Đã thu và nuôi đƣợc 684 trứng, tỷ lệ trứng trƣởng thành 84,92 ± 8, 63%.
• Bảo quản 197 trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong 36 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ trứng sống so với tổng sổ trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 79,90 ± 2,33 % (149 trứng).
3. Trứng bò chƣa chín (giai đoạn túi mầm)
• Bảo quản 477 trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt, tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 71,92 ± 2,20 % (91 trứng).
• Bảo quản 365 trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong 70 cọng rạ (0,25ml), tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng thu hồi sau giải đông theo đánh giá hình thái đạt 65,31 ± 2,69 % (172 trứng).
4.2. Kiến nghị
(1). Cần tiến hành thu nhận, nuôi và bảo quản trứng bò, heo theo các phƣơng pháp khác để chọn ra phƣơng pháp tối ƣu.
(2). Nuôi chín trứng sau khi đông lạnh (đối với trứng chƣa chín). (3). Tạo phôi từ những trứng đã đƣợc đông lạnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Huỳnh Thị Lệ Duyên (2003). Thiết lập quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở heo và xác định giới tính phôi. Luận văn Thạc sỹ.
2. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị ƣớc, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thúy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003). Kết quả thụ tinh ông nghiệm và cây phôi ở bò lai Sind.
Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 699-
702.
3. Hoàng Kim Giao, Nguyễn Thanh Dƣơng, Đỗ Kim Tuyên, Lƣu Công Khánh, Lê Thị
Thúy (1997). Công nghệ cấy truyền phôi bò. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 4. Nguyễn Thị Thƣơng Huyền, Võ Thị Tuyết Nga, Nguyễn Thị Thanh xuân, hoàng Thị
Bích Tuyền, Nguyễn Thị Phƣơng Dung, Đặng Thị Thu Thủy và Phan Kim Ngọc
(2008). Bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ. Hội nghị khoa học lần thứ 6, NXB Đại học quốc gia Tp. HCM. Trang 244.
5. Lƣu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Thị Kim Anh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê
Sơn, Chu Thị Yến, Đặng Vũ Hòa, Hoàng kim Giao (2003). Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol trong công nghệ cấy truyền phôi. Hội nghị CNSH
toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 720 - 722.
6. Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Hoa, (2003). Nuôi cấy phôi bò trong ống nghiệm. Tạp chí
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn; Tập 7; 854 - 858.
7. Nguyễn Văn Lý (2006). Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh trong ổng
nghiệm bò ở Việt Nam. Luận án tiến sỹ.
8. Nguyễn Thị Ƣớc, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Hoàng Nghĩa Sơn, Bùi
Xuân Nguyên (1999). Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh trong ống nghiệm. Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 934 -936.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
9. Abeydeera Lalantha R., Wang Wei-hua, Prather Randall s., and Day Billy N. (1998).
Maturatỉon In Vỉtro of Pig Oocytes ỉn Protein-Free Culture Medỉa: Fertỉlỉzatỉon and
Subsequent Embryo Development In Vitro. Biology of Reproduction 58,1316-1320.
10. Abdel Mohsen M. Hammam, Khalied H. El-Shahat (2005). Vitrifìcation of ỉmmature
and mature buffalo oocytes in glycerol solution hy a sỉmple method. Warsaw, Poland
Vol 1.
11. Aman, R.R. and J.E. Parks. (1994). Effects of cooling andrewarming on the meiotỉc
spindle and chromosomes of ỉn vitro-matured bovỉne oocytes. Biol. Reprod. 50:103-
12. Asada M., Fukui Y. (2000). Effect on fertilization and development by re-culture after
freezing and thawing of bovine oocytes matured in vitro. Theriogeneology, 54: 889 -
898.
13. Avery, B., Strobech, L., Jacobsen, T., Bogh, I.B. and Greve, T. (2003) In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on
nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology
59:987-999.
14. Begin I., Bhatia B., Baldassarre H., Dinnyes A., Keefer C. L., (2003).
Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2- to 4-cell embryos using the
cryoloop (CLV) and solid-surface vitrification (SSV) methods. Theriogenology, 59:
1839.
15. Bernard A., Fuller B. J. (1996). Cryopreservation of human oocytes: a review of current
problems and perspectives. Hum Reprod Update, 2: 193 -207.
16. Bols, P.E.J., Leroy, J.L.M.R., Vanholder, T. and Van Som, A. (2004) A comparision of a chemical sector and a linear array transducer for ultrasound-giuded
transvaginal oocyte retrieval (OPU) in the cow. Theriogenology 62: 906-914.
17. Chian Ri-Cheng, Kuwayama Masashige, Tan Leonard, Tan Justin, Kato Osamu and
Nagai Takashi (2004). High survival rate of bovine oocytes matured In Vitro following vitrification. Journal of Reproduction and Development, Vol. 50, No. 6,
pages 685 - 696.
18. Cetin Y, Bastan A (2006). Cryopreservation of immat ure bovine oocytes by vitrification
in straws. Anim Reprod Sci;92:29 36
19. Dinnyes A., Meng O., Polgar Z., Boonkusol D. & Somfai (2006). Cryopreservation of
mammalian embryos. Acta Scientiae Veterinariae. 34:171-90.
20. Dong-Hoon Kim va cs. (2007). Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The
Microdrop Method. Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4
21. Duque, P., Gomez, E., Diaz, E., Facal, N., Hidalgo, C. and Diez, C. (2003) Use of two
replacemDnt of serum during bovine embryo culture in vitro. Theriogenology 59:
889-899.
22. Edwards J. L., A. Saxton M., Lawrence J. L., Payton R. R. and Dunlap J. R.. (2005).
Exposure to a Physiologically Relevant Elevated Temperature Hastens In Vitro
Maturation in Bovine Oocytes. J. Dairy Sci., 88:4326-4333.
23. Eroglu, A., T. L. Toth and M. Toner. (1998). Alterations of the cytoskeleton and
polyploidy induced by cryopreservation of metaphase II mouse oocytes. Fertil. Steril.
69:944-957.
24. Fujihira T, Kishida R & Fukui Y (2004). Developmental capacity of vitrified immature porcine oocytes following ICSI: effects of cytochalasin B and cryoprotectants. Cryobiology 49, pages 286 290.
25. Fulka J., Motlik J. Crozet N. (1986). Activity of maturation promoting factor in
mammalian oocytes after its dilution by single and multiple fusions. Dev Biol, 118:
176.
26. Gook, D., S. Osborn, and W. Johnston. (1995). Parthenogenetic activation of human
oocytes following cryopreservation using 1,2-propanediol. Hum. Reprod. 10:793-798.
27. Gulyas, B.J. and L.C. Yuan. (1985). Cortical reaction and zona hardening in mouse
oocytes following exposure to ethanol. J. Exp. Zool. 233:269-276.
28. Gupta M., Uhm S., Lee H. (2006). Cryopreservation of immature and in vitro matured
porcine oocytes by solid surface vitrification. Theriogenology, Volume 67, Issue 2,
Pages 238-248
29. Hotamisligil S., Toner M., Powers R. D., (1996). Changes in membrane integrity,
cytoskeletal structure, and developmental potential of murine oocytes after vitrification in ethylene glycol. Biol Reprod, 55: 161.
30. Hurtt A.E., Landim-Alvarenga F., Seidel G.E., Jr. and Squires E.L. (2000).
Vitrification of Immature and Mature Equine and Bovine Oocytes in an Ethylene
Glycol, Ficoll and Sucrose Solution using Open-Pulled Straws. Theriogenology 54:
119- 128.
31. Iwasaki, S., Kono, T., Nakahara, T., Shioya, Y., Fukushima, M. and Hanada, A. (1987) New methods for the recovery of oocytes from bovine ovarian tissue in relation
to in vitro maturation and fertilization. Japanese journal of Animal Reproduction 33,
188-192.
32. Iwamoto M., Onishi A., Fuchimoto D., Somfai T., Takeda K., Tagami T., Hanada H.
(2005). Low oxygen tension during in vitro maturation of porcine follicular oocytes improves parthenogenetic activation and subsequent development to the blastocyst
stage. Theriogenology, Volume 63, Issue 5, Pages 1277-1289
33. Iwasaki, T., Kimura, E. and Totsukawa, T. (1999). Studies on a chemically defined medium for in-vitro culture of in-vitro matured and fertilised porcine oocytes.
Theriogenology 51: 709-720.
34. Johnson, M.H. and S.J. Pickering. (1987). The effect of dimethylsulphoxide on
the microtubular system of the mouse oocyte. Development 100:313-324.
35. Kazuhiro Kikuchi, Naomi Kashiwazaki, Junko Noguchi, Arata Shimada, Riichi Takahashi, Masumi Hirabayashi, Masao Shino, Masatsugu Ueda, and Hiroyuki Kaneko. (1999). Developmental Competence, after Transfer to Recipients, of Porcine
Oocytes Matured, Fertilized, and Cultured In Vitro. Biology of Reproduction 60.
36.Kim Dong-Hoon et al cs. (2007). Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The
Microdrop Method. Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4
37. Kulesshova L., Gianaroli L., Magli C, Ferraretti A., Trounson A. (1999). Birth
following vitrification of a small number of human oocytes. Hum Reprod, 14: 3077 -
3079.
38. Lane M., Schoolcraft WB, Garner DK. (1999). Vitrification of mouse and human
blastocysts using novel cryoloop container-less technique. Fertile Steril, 72: 1073 -
1078.
39. Lane, M. and D.K. Gardner. (2001). Vitrification of mouse oocytes using a nylon loop.
Mol. Reprod. Devel. 58:342-347.
40. Leibo, S.P. (1980). Water permeability and its activation energy of fertilized and
unfertilized mouse ova. J. Memb. Biol. 53:179-188.
41. Longergan, P., Vergos, E., Kinis, A., Sharif, H., Gallagher, M., Gordon, I. (1991).
The effect of recovery method on the type of bovine oocyte obtained for in-vitro
maturation. Theriogenology 35: 231 (abstr.).
42. Lonergan P., Carolan C. Mermillod P. (1994). Development of bovine embryos in vitro
following oocyte maturation under defined conditions. Reprod Nutr Dev, 34: 329.
43. Lonergan Pat, Carolan Catherine, Langendonckt Anne Van, Donnay Isabelle,
Khatir Hadj, and Mermillod Pascal (1996). Role of Epidermal Growth Factor in Bovine Oocyte Maturation and Preimplantation Embryo Development In Vitro.
Biology of Reproduction 54, 1420-1429.
44. Loos, de F., van Vliet, C, van Maurik, P. and Kruip, Th.A.M. (1989) Morphology of
immature bovine oocytes. Gamete Research 24: 197-204.
45. Lussier J.G., Matton P., Dufour J.J. (1987). Growth rates of follicles in the ovary of the
cow. J. Reprod Fertil, 81: 301.
46. Luyet B.J. (1937). Differential Staining for Living and Dead Cells. Journal Science, Volume 85,106
47. Maedomari N., Kikuchi K., Ozawa M., Noguchi J., Kaneko H., Ohnuma K., Nakai
M., Shino M., Nagai T., Kashiwazaki N. (2007). Cytoplasmic glutathione regulated
by cumulus cells during porcine oocyte maturation affects fertilization and embryonic development in vitro Theriogenology, Volume 67, Issue 5, Pages 983-993
48.Magistrini, M. and D. Szollosi. (1980). Effects of cold and isopropyl-N-phenylcarbamate