7. Sản phẩm đề tài
1.4.Ứng dụng của đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng là một phƣơng pháp dùng để lƣu trữ các tế bào trứng trong thời gian dài và đang đƣợc quan tâm nhiều vì phƣơng pháp này có nhiều ứng dụng ở cả ngƣời và động vật.
1.4.1. Ở người
Đứa bé đầu tiên trên thế giới ra đời từ trứng đông lạnh đƣợc ghi nhận vào năm 1986. Cho đến năm 2004, thống kê cho thấy trên thế giới có khoảng 40 bé đông lạnh trứng ra đời và trên dƣới 60 trƣờng hợp thai đang tiến triển. Tỷ lệ thai lâm sàng tò các chu kỳ trứng đông lạnh hiện còn khá thấp và không ổn định. Ngƣời ta ƣớc tính cần phải rã đông khoảng 100 trứng thì mới có một trƣờng hợp mang thai thành công. Nguyên nhân của thành công thấp có thể là: (1) Cấu trúc di truyền đặc biệt của trứng, khi các nhiễm sắc thể đang trong giai đoạn phân chia và xếp trên mặt phẳng xích đạo; (2) Tổn thƣơng của các cấu trúc nội bào do
quá trình trữ lạnh-rã đông; (3) Trứng là một tế bào có kích lớn, với lƣợng nƣớc bên trong chiếm khá nhiều [26].
Phƣơng pháp đông lạnh trứng thƣờng đƣợc sử dụng cho những trƣờng hợp sau: Phụ nữ còn trẻ hoặc không có bạn tình mà trứng của họ có nguy cơ bị phá hủy nặng nề do chiếu xạ, hóa trị liệu; Lập ngân hàng trứng hỗ trợ cho các chƣơng trình bệnh nhân không có noãn; Trong những trƣờng hợp không có tinh trùng để thụ tinh cần lƣu trữ trứng; Phụ nữ muốn trì hoãn tuổi sinh đẻ; Tránh những rắc rối về mặt luật pháp, tôn giáo của đông lạnh phôi đặc biệt ở những nƣớc mà đông lạnh phôi không đƣợc phép thực hiện [90].
1.4.2. Ở động vật
Bảo quản giao tử cái (trứng) làm cơ sở cho các nghiên cứu, ứng dụng sâu hơn: Dùng cho các nghiên cứu về IVF để cải thiện hiệu quả thụ tinh trong ống nghiệm; Việc đông lạnh trứng giúp vận chuyển dễ dàng, hạn chế lây lan dịch bệnh; Thiết lập ngân hàng để lƣu trữ nguồn di truyền của những động vật có nguy cơ tuyệt chủng hay quý hiếm; Trao đổi mua bán dễ dàng, đặc biệt là những loài có giá trị kinh tế cao [3,6].
CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung 1: Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa thủy tinh hóa
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1
2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng
Chuẩn bị
- Hấp vô trùng nƣớc muối sinh lý (0,9%), nƣớc cất, kéo, kẹp
- Bổ sung penicillin (100IU/ml) và streptomycin (0,1mg/ml) vào nƣớc muối sinh lý trƣớc khi sử dụng, để trong bình giữ ấm khoảng 33 - 350
C. Tiến hành
Dùng kéo thu nhận buồng trứng ở phía hai bên tử cung ngay khi heo vừa đƣợc mổ, rửa sạch cho vào nƣớc muối sinh lý chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (PTN) trong khoảng 2-3 giờ. Tại PTN, chọn những buồng trứng có các nang nổi đều, kích thƣớc trung bình khoảng 3-6mm. Loại bỏ mỡ, rửa sạch
Mẫu buồng trứng heo
Đông lạnh cọng ra
Đánh giá Giải đông Đông lạnh vi giọt
máu bằng nƣớc muối sinh lý đã bổ sung kháng sinh. Thực hiện thao tác thu trứng từ buồng trứng trong tủ thao tác 30 - 60 phút.
Hình 2.2: Mầu buồng trứng heo
2.1.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị
Dụng cụ bằng kim loại đƣợc rửa sạch và hấp khử trùng ở 1210C, latm hơi nƣớc trong 30 phút. Các đĩa petri và đĩa 4 giếng nhựa sử dụng một lần nên chỉ chiếu UV vỏ bọc trong 2 giờ trƣớc khi sử dụng. Tủ thao tác và kính hiển vi soi nổi đƣợc chiếu UV 15 phút trƣớc khi sử dụng, chiếu xong bật quạt hút 15 phút để hạn chế tác động có hại của tia UV còn sót lại. Chiếu UV vô trùng các dụng cụ: đèn cồn, găng tay, đầu kim 18G, syringe 5ml, kẹp, kéo, đĩa Pétri, đĩa Φ35, Φ60, đĩa 4 giếng, dung dịch D-PBS, nƣớc muối sinh lý, đầu tip, pipette Pasteur. Kéo pipette Pasteur với đƣờng kính khoảng 110 - 130μm.
Môi trƣờng thu trứng chuẩn bị trƣớc và ủ ấm ở 38,50
c tối thiểu 2 giờ trƣớc khi sử dụng (nhƣng không quá 20 giờ). Môi trƣờng chuẩn bị để thu trứng theo Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trường chuẩn bị thu trứng
Tên dụng cụ Môi trƣờng Thể tích Mục đích sử dụng
Becher 100 ml NaCl 0,9% bổ
sung kháng sinh 200 ml Rửa buồng trứng
Becher 50 ml D-PBS bô sung
kháng sinh 50 ml Thu dịch nang trứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đĩa Petri nhựa Φ35 D-PBS 3 ml Thu trứng từ dịch nang trứng
Đĩa 4 giếng
1 giọt IVM1 rửa trứng và 3 giọt IVM1 nuôi trứng
120 μl/giọt Rửa trứng + Nuôi trứng
Tiến hành
Vô trùng tay và lau lọ chứa mẫu bằng cồn 700 trƣớc khi thao tác trong tủ vô trùng - Đốt đèn cồn tạo không gian vô trùng, dùng kẹp gắp mẫu buồng trứng cho vào nƣớc muối sinh lý đã ủ ấm có bổ sung kháng sinh để rửa sạch. Sau đó gắp buồng trứng để lên miếng gạc nặn thật sạch máu.
- Dùng kim tiêm 18G gắn vào syringe 5ml hút khoảng 1ml D-PBS có bổ sung kháng sinh, tiến hành chọc - hút dịch trong các nang có đƣờng kính từ 3 -6mm, lƣợng D-PBS này có tác dụng pha loãng dịch nang trứng và trứng hút đƣợc, đồng thời giữ ổn định nhiệt cho trứng thu. Sau đó chuyển dịch nang trứng vào các đĩa Pétri nhựa (Φ35) và để lắng từ 5-10 phút trong tủ ấm 38,50 C.
- Dùng pipette Pasteur đã kéo gắn vào mouth pipette, soi tìm và phân loại trứng dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc hoặc kính hiển vi soi nổi. Trứng đƣợc phân loại theo nhóm tác giả Loos và cs (1989) [43]. Chuyển trứng sang giọt môi trƣờng IVM1 để rửa trứng và chuyển vào các giọt môi trƣờng nuôi. Sau 22-24
giờ, tiến hành chuyển trứng sang giọt môi trƣờng IVM2 tiếp tục nuôi đến 42 - 44 giờ.
Trong thao tác chọc hút trứng, mặt vát của kim tiêm cần đƣợc úp xuống để tránh bỏ sót trứng vì trứng cùng lớp tế bào hạt bao quanh bám ở đáy nang (phía cuống buồng trứng). Ngoài ra cần chú ý đặt mũi kim vào vị trí cách nang muốn chọc hút khoảng 3-5 mm rồi từ đó đƣa vào nang trứng và hút trứng ra tránh tình trạng áp suất lớn làm mất trứng.
Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng
Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ thống kính đảo ngược
2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh
Chuẩn bị emzyme
- Eppendorf chứa Hyaluronidase 1mg/ml đƣợc ủ ấm ở 38,50C trƣớc khi sử dụng 2 giờ. - Đĩa Petri nhựa Φ35 chứa giọt môi trƣờng IVM1 ủ ấm trƣớc khi sử dụng 2 giờ.
Loại cumulus và quan sát
- Tạo giọt hyaluronidase trên đĩa Petri nhựa
- Sau 42 - 44 giờ nuôi cấy, sử dụng mouth pipette có gắn pipette Pasteur chuyển trứng vào giọt Hyaluronidase và vortex trong vòng 30 giây để loại bỏ cumulus.
- Các tế bào trứng sau khi loại cumulus gọi là các tế bào trứng trần sẽ đƣợc chuyển vào giọt môi trƣờng IVM1.
- Quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc, đánh giá sự trƣởng thành của trứng thông qua: sự đồng nhất về tế bào chất của trứng và sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
- Chỉ những trứng có tế bào chất đồng đều và có thể cực thứ nhất mới đƣợc sử dụng cho quá trình đông lạnh.
2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1)
Chuẩn bị
- Bình nitơ lỏng, cryotube, mouth pipette có gắn pipette Pasteur, hộp xốp chứa nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi
- Chuẩn bị 2 đĩa Petri nhựa 035: Đĩa số 1 chứa 100μ1 môi trƣờng VS1 (TCM-199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG), đĩa số 2 chứa 300μ1 môi trƣờng VS2 (TCM-199 10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose). Đặt 2 đĩa ở nhiệt độ phòng (250
C) khoảng 15 phút trƣớc khi sử dụng.
Tiến hành
- Sau khi IVM 42 - 44 giờ và đã loại bỏ cumulus, ta chọn những trứng có tế bào chất đồng đều và có thể cực thứ nhất chuyển vào đĩa số 1 (môi trƣờng VS1) để trong vòng 45 giây. Chuyển trứng sang đĩa số 2 (môi trƣờng VS2), dùng mouth pipette có gắn pipette Pasteur hút khoảng 5μl tạo vi giọt có chứa 5-7 trứng và nhỏ trực tiếp vào hộp xốp chứa nitơ lỏng trong vòng 25 giây. Lần lƣợt tạo vi giọt đông lạnh tất cả các trứng có đƣợc, sau đó dùng kẹp tìm và gắp các vi giọt cho vào cryotube (lƣu ý không bỏ sót vi giọt). Dùng bông nhét kín miệng cryotube và nhanh chóng chuyển cryotube vào bình chứa nitơ lỏng để bảo
Hình 2.5. Sơ đồ bổ trí đĩa vi giọt đông lạnh
Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.8. Chuyển vì giọt vào cryotube
2.1.5. Phương pháp giải đông các vi giọt được đông lạnh
Chuẩn bị
Chuẩn bị 1 đĩa nhựa Φ35 trống; 1 đĩa 4 giếng: giếng 1 chứa môi trƣờng RĐ1 (TCM- 199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose), giếng 2 chứa môi trƣờng RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose), giếng 3 chứa môi trƣờng RĐ3 (TCM-199 + 10% FBS), giếng 4 chứa môi trƣờng IVM2 (dùng để đánh giá sống chết).
Tiến hành
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó cho vào bể ổn nhiệt 5 giây và chuyển môi trƣờng bên trong cọng rạ vào đĩa nhựa Φ35 trống. Chuyển trứng sang giếng số 1 của đĩa 4 giếng chứa môi trƣờng RĐ1, giữ khoảng 1,5 phút ở nhiệt độ phòng (250C). Chuyển trứng qua giếng số 2 chứa môi trƣờng RĐ2, giữ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục chuyển trứng vào giếng số 3 chứa môi trƣờng RĐ3, giữ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng sang giếng số 4 chứa môi trƣờng IVM2, để đánh giá sự sống chết của trứng.
Hình 2.9. Thao tác đổ vị giọt ra khỏi cryotube
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông
❖ Lƣu ý:
• Mỗi lần chuyển trứng sang các giọt môi trƣờng tƣơng ứng, trứng sẽ bị co lại vì vậy cần quan sát hình thái của trứng dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc để không bị mất mẫu.
2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2)
Chuẩn bị
Môi trƣờng VS1 :TCM-199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dùng để cân bằng trứng
Môi trƣờng VS2: TCM-199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dùng để bảo quản trứng ở -196°C
Cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), bình nhơ lỏng
Tiến hành
Sau 22 - 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bƣớc: Trứng đang giữ trong môi trƣờng C3 sẽ đƣợc cân bằng trong môi trƣờng VS1 (TCM-199 + 10% FBS +10% DMSO + 10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trƣờng VS2 (TCM-199 +10% FBS + 20% DMSO + 20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây.
Cách chuyển trứng vào cọng rạ nhƣ sau: hút 1 khoảng môi trƣờng VS2, sau đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trƣờng VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trƣờng VS2 (Hình 2.11) và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa. Đƣa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh).
Giải đông trứng
Trứng đƣợc rã đông theo 03 bƣớc. (Xem 2.1.4)
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nƣớc ấm 33 - 350
C, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống.
Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trƣờng giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trƣờng RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trƣờng RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trƣờng nuôi trứng, để trong tủ nuôi (38,50C, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng đểDùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trƣờng giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trƣờng RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trƣờng RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trƣờng nuôi trứng, để trong tủ nuôi (38,50
C, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trƣớc khi đánh giá sự sống chết của trứng.
Hình2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng
Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nước ấm
Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trường RĐ
2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng
- Trứng sống: mảng tế bào còn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và không bị co, không bị phân mảnh.
- Trứng chết: màng tế bào bị tổn thƣơng trong quá trình đông lạnh, nên tế bào chất bị co hoặc phân mảnh, màng tế bào có tể bị gãy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2. Nội dung 2: Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) tinh hóa trong cọng rạ (PP2)
Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2
2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng
Xem 2.1.1
2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị Chuẩn bị
NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin
0,1 mg/ml (S9137, Sigma). Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Giải đông trứng Đông lạnh trong cọng ra Đánh giá
Dung dịch D - PBS: môi trƣờng sử dụng để thu dịch nang trứng. Trƣớc khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,lmg/ml và ủ ấm ở 370C.
Môi trƣờng Flushing (FLUSH 050, FertiPro) (môi trƣờng W2): sử dụng để rửa trứng trƣớc khi IVM.
TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF (môi trƣờng C3): cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma); dạng dung dịch đƣợc sử dụng để phá các tế bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đƣờng kính 120μm, mouth pipette, bercher, erlen
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật)
❖ Thu nhận trứng
Thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút (Xem phần 2. 1 .2)
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
❖ Nuôi trứng trƣởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D - PBS cho vào các giếng có môi trƣờng W2 và C3 để rửa.
- Sau đó cho khoảng 20 - 30 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trƣờng C3 (loại đĩa 4 giếng chứa 500 μl/giếng và phủ dầu khoáng). Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,50C, 5% CO2, hơi nƣớc bão hòa. Lƣu ý: Môi trƣờng C3 cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, đánh giá sự trƣởng thành của trứng bằng cách tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trƣởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng
2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phương pháp 2
2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa pháp thủy tinh hóa
Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3
2.3.1.Thu nhận buồng trứng
Xem phần 2.1.1.
2.3.2.Thu nhận trứng
Xem phần 2.2.2 (Không tiến hành nuôi) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3.Đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 1 (Xem 2.1.4) Đông lạnh trứng trong cọng rạ (Xem 2.1.6)
Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Đông lạnh trong cọng rạ Đông lạnh trong vi giọt Đánh giá Giải đông trứng
2.3.4. Phương pháp giải đông
Giải đông trứng đông lạnh trong vi giọt (Xem 2.1.5) Giải đông trứng đông lạnh trong cọng rạ (Xem 2.1.6
2.4. Xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu đƣợc trong nghiên cứu đều đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel - 2007 với độ tin cậy 95%. Dùng hàm Descriptive Statistics, t-Test Two-Sample Assuming Equal Variances, t-Test Two- Sample Assuming Unequal Variances.
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả nội dung 1
3.1.1. Kết quả thu nhận trứng
Trứng heo đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chọc hút (Hình 3.1), kết quả thể hiện ở