Xem 2.1.1
2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị Chuẩn bị
NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin
0,1 mg/ml (S9137, Sigma). Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Giải đông trứng Đông lạnh trong cọng ra Đánh giá
Dung dịch D - PBS: môi trƣờng sử dụng để thu dịch nang trứng. Trƣớc khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,lmg/ml và ủ ấm ở 370C.
Môi trƣờng Flushing (FLUSH 050, FertiPro) (môi trƣờng W2): sử dụng để rửa trứng trƣớc khi IVM.
TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF (môi trƣờng C3): cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma); dạng dung dịch đƣợc sử dụng để phá các tế bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đƣờng kính 120μm, mouth pipette, bercher, erlen
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật)
❖ Thu nhận trứng
Thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút (Xem phần 2. 1 .2)
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
❖ Nuôi trứng trƣởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D - PBS cho vào các giếng có môi trƣờng W2 và C3 để rửa.
- Sau đó cho khoảng 20 - 30 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trƣờng C3 (loại đĩa 4 giếng chứa 500 μl/giếng và phủ dầu khoáng). Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,50C, 5% CO2, hơi nƣớc bão hòa. Lƣu ý: Môi trƣờng C3 cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, đánh giá sự trƣởng thành của trứng bằng cách tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trƣởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng
2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phương pháp 2
2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa pháp thủy tinh hóa
Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3
2.3.1.Thu nhận buồng trứng
Xem phần 2.1.1.
2.3.2.Thu nhận trứng
Xem phần 2.2.2 (Không tiến hành nuôi)
2.3.3.Đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 1 (Xem 2.1.4) Đông lạnh trứng trong cọng rạ (Xem 2.1.6)
Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Đông lạnh trong cọng rạ Đông lạnh trong vi giọt Đánh giá Giải đông trứng
2.3.4. Phương pháp giải đông
Giải đông trứng đông lạnh trong vi giọt (Xem 2.1.5) Giải đông trứng đông lạnh trong cọng rạ (Xem 2.1.6
2.4. Xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu đƣợc trong nghiên cứu đều đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel - 2007 với độ tin cậy 95%. Dùng hàm Descriptive Statistics, t-Test Two-Sample Assuming Equal Variances, t-Test Two- Sample Assuming Unequal Variances.
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả nội dung 1
3.1.1. Kết quả thu nhận trứng
Trứng heo đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chọc hút (Hình 3.1), kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. và Biểu đồ 3.1.
Hình 3.1. Trứng heo được thu nhận từ buồng trứng (X100)
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo
Số đợt TN Số buồng
trứng Tổng trứng
Số
trứng buồng Loại A Loại B 10 80 1733 21,66 ± 0,27 41,68 ± 0,69%
(723 trứng)
27,37 ± 0,69% (474 trứng) α < 0,05
Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng
Tiến hành chọc hút 80 buồng trứng, thu đƣợc 1733 trứng các loại, nhƣ vậy trung bình thu đƣợc 21,66 trứng/buồng. Trong đó những trứng đƣợc chọn nuôi là các trứng loại A chiếm tới 41,68% (723 trứng) và loại B đạt 23,37% (474 trứng), còn lại 34,95% (536 trứng) là trứng loại C. Ở đây tỷ lệ trứng loại C khá cao vì thông thƣờng lớp cumulus bao quanh trứng heo rất lỏng lẻo, dễ bị bong ra nếu dùng lực hút và đẩy mạnh. Chính vì vậy, thao tác thu nhận trứng đòi hỏi phải điều chỉnh lực đẩy của xi lanh để hạn chế trứng xấu. Bên cạnh đó, vì nguồn mẫu buồng trứng thu nhận từ lò mổ nên có thể chất lƣợng mẫu không đảm bảo sự tƣơng đồng về các chỉ tiêu cần thiết: tuổi buồng trứng, chất lƣợng buồng trứng, kích thƣớc nang trứng
3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM)
Những trứng loại A và B đem nuôi cấy qua 2 môi trƣờng VM1 và VM2 nhƣ đã trình bày ở trên. Sau 44 giờ, thu và vortex trứng bằng hyaluronidase 0,1% để loại cumulus nhằm quan sát thể cực (Hình 3.2). Thí nghiệm đƣợc tiến hành 10 đạt, kết quả ghi nhận ở Bảng 3.2. và Biểu đồ 3.2.
Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất
Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo
Số đợt TN Số trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín
10 1189 65,42 ± 0,79%
(779 Trứng) α < 0,05
Sau 10 lần thí nghiệm, tổng số đã chọn đƣợc 1189 trứng tốt dùng để nuôi. Sau 44 - 48 giờ nuôi cấy, có 779/1189 trứng chín, đạt tỷ lệ trung bình 65,42 ± 0,79%. Tỷ lệ này khá cao so với tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2004) chỉ đạt 18,3%. Đồng thời khi so sánh với một số kết quả đƣợc công bố trên thế giới thì thấy kết quả IVM trứng heo của chúng tôi cũng không có sự cách biệt mấy: Abeydeera Lalantha R. và cs. (1998, 80 - 85%); Kazuhiro và cs. (1999) là 68%; Yamauchi và cs. (1999, 60 - 70%); Marques và cs. (2006) là 65%; Maedomari (2007, 64,5%). Tuy nhiên, kết quả này thấp so với các tác giả khác trên thế giới nhƣ: Iwamoto (2005, 73,00%). Tỷ lệ trứng chín thấp hơn nhƣ thế là do các nguyên nhân sau:
- Địa điểm lấy mẫu nằm cách xa phòng thí nghiệm và thu mẫu vào đêm khuya (24giờ) nên thời gian vận chuyển mẫu về nơi xử lý khá lâu. Bên cạnh đó, dụng cụ ổn nhiệt trong quá trình thu mẫu do đƣợc tự chế nên không đảm bảo hệ thống ổn nhiệt trong quá trình vận chuyển mẫu. Hai yếu tố này ảnh hƣởng gián tiếp đến tỷ lệ sống, chết và sự trƣởng thành của trứng trong quá trình nuôi cấy.
- Mẫu buồng trứng thu nhận từ lò mổ nên không biết rõ độ tuổi, yếu tố di truyền của con giống. Các trứng thu nhận từ buồng trứng có thể ở nhiều giai đoạn khác nhau của sự phát triển nên khả năng trƣởng thành của trứng diễn ra không đồng thời tại một thời điểm.
- Thao tác thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút cũng tác động không tốt đến trứng vì chọc hút bằng kim 18G gây áp lực hút quá mạnh làm mất tính liên kết của phức hợp trứng - cumulus (Cumulus - Oocyte Complex_COC) ảnh hƣởng khả năng trƣởng thành của trứng. Thao tác chuyển trứng bằng hệ thống mouth pipette và pipette Pasteur còn chậm làm cho trứng phải tiếp xúc trực tiếp với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ánh sáng trong khoảng thời gian dài. Chính các lý do này cũng góp phần vào việc ảnh hƣởng đến tỷ lệ trƣởng thành của trứng.
- Bên cạnh đó, do điều kiện phòng thí nghiệm không cho phép, kết quả là thời gian thực hiện IVM quá lâu nên trứng một phần nào bị thoái hóa. Ngoài ra, chính tác nhân enzyme hyaluronidase, tác động cơ học bằng máy vortex và việc hút rửa loại cumulus và enzyme bằng pipette Pasteur đã tác động xấu đến trứng vì màng tế bào động vật rất mỏng manh, đặc biệt là màng tế bào trứng.
3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1
Sử dụng số trứng metaphase II có xuất hiện thể cực đã thu nhận đƣợc từ các thí nghiệm trên, tiến hành quy trình đông lạnh và giải đông theo trình tự các bƣớc; ghi nhận kết quả trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1
Số đợt TN Số vi giọt Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 8 43 305 68,25 ± ,81% (216 trứng) 46,15 ± 5,63% (91 trứng) 29,92 ± 2,82% α < 0,05 ❖ Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành 8 đạt thí nghiệm với tổng số trứng đem đông lạnh là 305 trứng. Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đông đạt 68,25 ± 6,81%. Có tới 31,75% trứng bị thất thoát trong quá trình giải đông (Biểu đồ 3.3). Điều này có thể đƣợc lý giải nhƣ sau:
Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1
- Vi giọt đông lạnh có thể tích rất nhỏ và hơi lạnh của nitơ làm hạn chế tầm nhìn nên dẫn đến việc rất dễ sót một số vi giọt có chứa trứng trong hộp đựng nitơ lỏng. Chính điều này làm cho khả năng bỏ sót trứng trong quá trình thu nhận vi giọt vào cryotube rất cao.
- Môi trƣờng thủy tinh hóa VS1 và VS2 có nồng độ các chất bảo quản cao dần làm cho hai dung dịch này có độ nhớt đặc trƣng, đặc biệt là môi trƣờng VS2 Việc này gây khó khăn cho quá trình thu nhận trứng vì chiết suất của môi trƣờng thay đổi liên tục làm cho việc quan sát trứng dƣới kính hiển vi rất khó kiểm soát. Bên cạnh đó, giới hạn về thời gian xử lý trứng trong các môi trƣờng thủy tinh hóa rất ngắn (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2) nên việc bỏ sót trứng là không thể tránh khỏi.
- Chất bảo quản đông lạnh có tính thấm cao có thể gây ra sự thay đổi lớn về thể tích tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và giải đông. Bên cạnh đó, môi trƣờng ngoại bào sẽ trở nên ƣu trƣơng hơn bởi vì nồng độ chất tan tăng lên so với nồng độ môi trƣờng nội bào. Vì thế nƣớc sẽ rời khỏi tế bào và kết quả là tế bào co lại. Đây chính là lý do trứng thƣờng bị mất ở môi trƣờng thủy tinh hóa trong khi thao tác.
- Tƣơng tự khi thu hồi trứng từ vi giọt đông lạnh trong môi trƣờng VS2 khả năng bỏ sót trứng là rất cao. Ngoài ra, vi giọt chứa trứng cũng thƣờng bị sót lại trong cryotube. Hơn nữa, thao tác giải đông chậm còn làm cho vi giọt tan ra trong cryotube gây khó khăn cho việc thu nhận trứng và làm thất thoát một số lƣợng trứng không nhỏ.
❖ Tỷ lệ sống chết
Từ số trứng thu hồi đƣợc sau giải đông, chúng tôi tiến hành đánh giá tỷ lệ sống chết bằng cách quan sát hình thái.
Hình 3.3. Trứng sống Hình 3.4. Trứng có tế bào chất phân mảnh
Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại
Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sổng, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP1
Tỷ lệ trứng sống khi quan sát hình thái của tất cả các thí nghiệm còn thấp (46,15%) so với các công trình nghiên cứu trên thế giới đã đƣợc công bố trong
thời gian gần đây. Năm 2004, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và giải đông trứng heo bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ ethylene glycol (EG) trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu đƣợc tỷ lệ sống sau giải đông là 54 - 56%. Năm 2006, nhóm tác giả Gupta, Uhm và Lee - thực hiện đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa sử dụng bề mặt rắn (Solid Surface Vitrification_SSV) có xử lý với cytochalasin B, thu đƣợc tỷ lệ sống về mặt hình thái sau giải đông hơn 60%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chƣa cao, điều này có thể giải thích nhƣ sau:
- Chất lƣợng trứng nuôi chín không ổn định ở các lần thí nghiệm nhƣ đã trình bày ở trên.
- Ảnh hƣởng của enzyme hyaluronidase trong quá trình vortex loại bỏ cumulus và thời gian vortex quá mức cũng phần nào tác động đến tính toàn vẹn của màng tế bào chất.
- Phƣơng pháp thủy tinh hóa đòi hỏi sự chính xác về thời gian, trứng chỉ tiếp xúc với các dung dịch thủy tinh hóa trong vòng vài giây (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2). Bên cạnh đó, thao tác đông lạnh và giải đông bằng vi giọt còn khá mới, điều làm cho thời gian chuyển trứng giữa các môi trƣờng không đảm bảo gây ảnh hƣởng không tốt đến khả năng sống của trứng. Sự khử nƣớc bên trong tế bào trứng xảy ra trong suốt quá trình đông lạnh rất cần cho khả năng sống của trứng sau giải đông. Tế bào trứng hình cầu nên tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích của trứng thấp dẫn đến lƣợng nƣớc mất không hoàn toàn trong quá trình khử nƣớc. Sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa tránh đƣợc sự hình thành tinh thể đá nội bào nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn nhƣ thủy tinh, xảy ra một cách nhanh chóng. Nhƣng do kỹ thuật thao tác, thời gian xử lý trứng trong dung dịch thủy tinh hóa chƣa chuẩn xác dẫn đến việc thực hiện khâu khử nƣớc trong môi trƣờng VS chƣa đạt, nên vẫn còn sự xuất hiện tinh thể đá bên trong tế bào, gây đứt gãy ở màng tế bào chất và kết quả là tế bào trứng chết. Trƣờng hợp thời gian xử lý trứng trong dung dịch thủy tinh hóa quá lâu thì
nồng độ quá cao của các chất bảo quản cũng có khả năng gây độc và ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của trứng.
- Quy trình đông lạnh thƣờng đòi hỏi tế bào tiếp xúc với một hay nhiều chất bảo quản đông lạnh với nồng độ cao, nồng độ các chất này đặc biệt cao ở phƣơng pháp thủy tinh hóa. Việc thêm chất bảo quản đông lanh với nồng độ cao sẽ làm dung dịch ngoại bào ƣu trƣơng hơn nhiều. Kết quả là khi tế bào tiếp xúc với dung dịch này, sẽ có khuynh huớng lệch thể tích, có thể làm tổn hại đến màng và ảnh hƣởng đến khả năng sống của tế bào.
- Sự hiện diện dày đặc của các giọt lipid bên trong bào tƣơng trứng heo là trở ngại rất lớn cho việc đông lạnh trứng heo vì lipid làm giảm khả năng chống chịu lạnh của trứng và gây tổn thƣơng màng tế bào khi hạ nhiệt độ.
3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2
Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2
Số đợi TN
Số cọng rạ
Số trứng
đem ĐL Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 10 71 386 80,70 ± 1,55% (313 trứng) 47,54 ± 0,60% (149 trứng) 38,39 ± 1,02% α < 0,05
Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2
Thí nghiệm đƣợc tiến hành 10 đạt với 386 trứng bào quản trong 71 cọng rạ bằng PP2, sau khi giải đông thu lại đƣợc 313 trứng (80,70%). Nhƣ vậy tỷ lệ thu hồi khá cao, tuy nhiên vẫn còn gần 20% lƣợng trứng bị thất thoát trong quá trình thí nghiệm (Biểu đồ 3.5). Chính điều này cũng ảnh hƣởng phần nào đến tỷ lệ sống của trứng sau giải đông.
Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so vói tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2
Tỷ lệ trứng sống sau giải đông trên tổng số trứng thu hồi đƣợc chỉ đạt 47,54% (149/313 trứng). Nếu tính theo tổng số trứng đem đông lạnh thì kết tỷ lệ
sống của trứng sau giải đông còn thấp hơn nhiều, chỉ đạt 38,39%. Kết quả này cao hơn kết quả của nhóm tác giả Wu Caihong và cs (2006, 41,9%). Tuy nhiên, kết quả này cũng thấp hơn so với các kết quả đã đƣợc công bố trên thế giới: Gupta và cs (2006; trên 60%); Somfai và cs (2008, 98,6%). Riêng ở Việt Nam cho đến nay chƣa có công trình nào công bố kết quả đông lạnh trứng heo. Chính vì vậy, kết quả của chúng tôi đã bƣớc đầu khẳng định về sự thành công trong bảo quản trứng heo.
3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phương pháp thủy tinh hóa trứng heo
Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo
Phƣơng pháp thủy tinh hóa
Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu bồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL Vi giọt 305 68,25 ±6,81% 46,15 ±5,63% 29,92 ± 2,82% Cọng rạ 386 80,70 ±1,55% 47,54 ± 0,60% 38,39 ± 1,02% Mức ý nghĩa α < 0,05 α > 0,05 α < 0,05 Mức ý nghĩa
Từ Bảng 3.5 vả Biểu đồ 3.7. cho thấy việc bảo quản trứng heo trƣởng thành bằng PP2