2. 3 Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 2
3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2
Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2
Số đợi TN
Số cọng rạ
Số trứng
đem ĐL Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 10 71 386 80,70 ± 1,55% (313 trứng) 47,54 ± 0,60% (149 trứng) 38,39 ± 1,02% α < 0,05
Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2
Thí nghiệm đƣợc tiến hành 10 đạt với 386 trứng bào quản trong 71 cọng rạ bằng PP2, sau khi giải đông thu lại đƣợc 313 trứng (80,70%). Nhƣ vậy tỷ lệ thu hồi khá cao, tuy nhiên vẫn còn gần 20% lƣợng trứng bị thất thoát trong quá trình thí nghiệm (Biểu đồ 3.5). Chính điều này cũng ảnh hƣởng phần nào đến tỷ lệ sống của trứng sau giải đông.
Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so vói tổng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2
Tỷ lệ trứng sống sau giải đông trên tổng số trứng thu hồi đƣợc chỉ đạt 47,54% (149/313 trứng). Nếu tính theo tổng số trứng đem đông lạnh thì kết tỷ lệ
sống của trứng sau giải đông còn thấp hơn nhiều, chỉ đạt 38,39%. Kết quả này cao hơn kết quả của nhóm tác giả Wu Caihong và cs (2006, 41,9%). Tuy nhiên, kết quả này cũng thấp hơn so với các kết quả đã đƣợc công bố trên thế giới: Gupta và cs (2006; trên 60%); Somfai và cs (2008, 98,6%). Riêng ở Việt Nam cho đến nay chƣa có công trình nào công bố kết quả đông lạnh trứng heo. Chính vì vậy, kết quả của chúng tôi đã bƣớc đầu khẳng định về sự thành công trong bảo quản trứng heo.
3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phương pháp thủy tinh hóa trứng heo
Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo
Phƣơng pháp thủy tinh hóa
Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu bồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL Vi giọt 305 68,25 ±6,81% 46,15 ±5,63% 29,92 ± 2,82% Cọng rạ 386 80,70 ±1,55% 47,54 ± 0,60% 38,39 ± 1,02% Mức ý nghĩa α < 0,05 α > 0,05 α < 0,05 Mức ý nghĩa
Từ Bảng 3.5 vả Biểu đồ 3.7. cho thấy việc bảo quản trứng heo trƣởng thành bằng PP2 có tỷ lệ thu hồi cao hơn PP1, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (α < 0,05). Tỷ lệ trứng sống sau giải đông so với số lƣợng trứng thu hồi ở cả 2 phƣơng pháp bảo quản không có sự khác biệt về mặt thống kê (α > 0,05). Tuy nhiên, khi xét theo tổng số trứng đem đông lạnh, thì tỷ lệ trứng sống theo bảo quản PP2 cao hơn PP1 và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (α < 0,05). Nhƣ vậy, ta có thể chọn một trong hai phƣơng pháp bảo quản trên để bảo quản trứng heo trƣởng thành; đồng thời cần tiến hành nghiên cứu thêm các phƣơng pháp bảo quản khác để tìm ra phƣơng pháp tốt nhất.
3.2. Kết quả nội dung 2
3.2.1. Kết quả thu nhận trứng
Hình 3.6. Trứng bò thu nhận từ dịch nang trứng theo phương pháp chọc hút (X40)
Bảng 3.6. Kết quả thu nhận trứng bò
Số đợt TN Số buồng
trứng Tổng trứng
Số trứng
buồng Số đợi TN Số buồng trứng 9 50 909 18,55 ± 1,12 56,51 ± 1,58%
(512 trứng)
18,94 ± 0,0,35% (172 trứng) α < 0,05
Qua 9 lần thực hiện, tổng cộng có 50 buồng trứng với tổng số trứng thu đƣợc là 909 trứng, lƣợng trứng trung bình trên một buồng là 18,55 ± 1,22 trứng. Kết quả này cao hơn các nghiên cứu của Iwasaki và cs., 1987 (14,0); Lonergan và cs., 1991 (9,7).; Nguyễn Thị Ƣớc và cs., 1999 (9,4); Nguyễn Văn Lý và cs., 2006 (14,41). Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc là khá cao so với một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc. Tuy nhiên, kết quả này chƣa cao nhƣ nghiên cứu của Pavlok và cs. 1991 (25,87 trứng). Theo báo cáo của thế giới, số trứng thu nhận từ phƣơng pháp chọc hút có thể lên đến 30 trứng/buồng trứng. Kết quả của chúng tôi chƣa thể đạt đƣợc nhƣ vậy có thể do thao tác chọc-hút trong điều kiện ánh sáng hạn chế dẫn đến việc chọc sót nang trứng chất lƣợng trứng, cũng nhƣ sót trứng trong quá trình soi tìm.
Sau khi tiến hành 9 đợt thí nghiệm, phân loại trên tổng số 909 trứng với kết quả nhƣ sau: Trứng loại A có 512 trứng chiếm tỷ lệ 56,51%; trứng loại B có 172 trứng chiếm tỷ lệ 18,94%; còn lại 225 trứng loại C chiếm 24,55%. Trứng loại A thu đƣợc cao gần gấp 3 lần trứng loại B và gấp 2 lần trứng loại C (Biểu đồ 3.8).
Biểu đồ 3.8. Kết quả thu nhận trứng bò từ mẫu buồng trứng
Tỷ lệ trứng loại A thu đƣợc cao hơn so với kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs. năm 2003 (41,30%); của Hamano và Kuwayama năm 1993 (40,80%). Tuy nhiên, kết quả thu đƣợc vẫn còn thấp hơn nhiều so với tỷ lệ 90% trong nghiên
cứu của Iwasaki và cs. (1987) khi thu nhận trứng từ nguồn siêu âm. Tỷ lệ trứng loại C thấp hơn kết quả của Nguyễn Văn Lý năm 2006 (28,56%).
Trong số 909 trứng đƣợc phân loại thì những trứng có khả năng dùng cho IVM là trứng loại A và B với tổng số 684 trứng chiếm tỷ lệ 84,92%. Kết quả này cũng cao hơn nghiên cứu của Nguyễn Văn Lý năm 2006 (76,44%). Điều này cho thấy thao tác chọc-hút trong quá trình thí nghiệm là khá chuẩn, khi thực hiện thao tác chọc-hút nang trứng dùng lực vừa đủ để hạn chế tối đa ảnh hƣởng đến lớp cumulus. Song, để có thể tiếp tục nâng cao hơn nữa tỷ lệ trứng đem nuôi thì cần khắc phục một số hạn chế sau:
■ Nâng cao chất lƣợng nguồn mẫu: Đa số các bò cái giết mổ là những bò cái thải loại, bò già hay bò có sức sinh sản yếu. Các buồng trứng thu đƣợc đôi khi có kích thƣớc nhỏ, không có hình dạng xác định, có thể vàng tồn lƣu. Chất lƣợng buồng trứng ảnh hƣởng đến các kết quả IVM cũng nhƣ IVF.
■ Thao tác thu trứng: Phƣơng pháp chọc-hút cho phép thu đƣợc số lƣợng trứng nhiều, nhanh; do đó làm tăng khả năng thành công khi tiến hành IVM nhờ hạn chế đƣợc các ảnh hƣởng bất lợi của môi trƣờng: nhiệt độ, khả năng nhiễm khuẩn, ánh sáng, hàm lƣợng khí Tuy nhiên, chọc-hút có thể làm phá vỡ liên kết của COC, ảnh hƣởng xấu đến hiệu quả IVM. Chính vì vậy, thao tác nhẹ, nhanh với lực vừa đủ sẽ quyết định kết quả thu trứng.
3.2.2. Kết quả nuôi trứng bò
Chọn các trứng loại A và B đem nuôi trong môi trƣờng C2 ở 38,50 C, 5% CO2. Sau 22-24 giờ nuôi, dựa trên độ giãn nở của lớp cumulus và sự xuất hiện thể cực thứ I để đánh giá sự trƣởng thành của trứng (Hình 3.7 và 3.8). Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.7. và Biểu đồ 3.9.
Hình 3.7. Trứng bò sau khi IVM có lớp cumulus giãn nở (X100)
Hình 3.8. Trứng bò sau khi IVM xuất hiện thể cực I (X400)
Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng bò
Số đợi TN Số trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín
9 684 84,92 ± 0,63%
(580 trứng) α < 0,05
Biểu đồ 3.9. Kết quả nuôi trứng bò
Có tổng cộng 684 trứng đem nuôi, tỷ lệ trứng trƣởng thành thu đƣợc là 84,92%. Kết quả này cao hơn công bố của tác giả Ocana-Quero và cs. (1998; 70,1%); Nguyễn Thị Ƣớc và cs. (2003; 65,61%); của Nguyễn Hữu Đức và cs.
(2003; 76,83%); của Nguyễn Văn Lý (2006; 76,83%). Kết quả này không khác biệt so với nghiên cứu của tác giả Edwards J. L. và cs. (2005; 83,9%). Tuy nhiên kết quả thu đƣợc lại thấp hơn các công trình đã đƣợc công bố: Saeki K. và cs. (1994; 90%); Lonergan Pat và cs. (1996; 87 - 96%); các tác giả Duque và cs. 2003, Avery và cs. 2003; Bols và cs. 2004, Pereira và cs. 2005, Rizos và cs. 2005, Park và cs. 2005 có tỷ lệ nuôi trứng chín đạt từ 70 - 90%. Nhƣ vậy, kết quả IVM trứng bò của thí nghiệm chúng tôi cũng khá cao. Kết quả này một lần nữa khẳng định thao tác và kỹ thuật của nhóm nghiên cứu nâng cao dần.
3.2.3. Kết quả đông lạnh trứng bò
Các trứng đƣợc cho là trƣởng thành sau khi IVM dựa vào độ giãn nở của cumulus đƣợc đông lạnh bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng ra theo 2 bƣớc. Sau khi giải đông, tỷ lệ sống chết đƣợc đánh giá theo hình thái (Hình 3.9 và 3.10), kết quả thể hiện ở Bảng 3.8.
Hình 3.9. Trứng sống sau giải
đông (X100)
Bảng 3.8. Kết quả đông lạnh trứng bò chín bằng PP2 Số đợt TN Sổ cọng rạ Sổ trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 9 36 197 84,43 ± 1,84% (166 trứng) 79,90 ± 2,33% (149 trứng) 67,73 ± 3,18% α < 0,05
Biểu đồ 3.10. Kết quả thu hồi trứng bò chín sau giải đông
Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.8 có thể thấy số lƣợng trứng thu đƣợc sau giải đông đạt tỷ lệ 84,43 ± 1,84% (166/197 trứng), điều này cho phép khẳng định khả rằng sau khi đông lạnh, khả năng thu hồi lại đƣợc số lƣợng trứng là khá cao. Tỷ lệ trung bình trứng sống so với tổng số trứng thu đƣợc sau giải đông là 79,90 ± 2,33% (Biểu đồ 3.11); và so với tổng số trứng đƣợc đông lạnh chỉ đạt 67,73%. Kết quả này còn thấp hơn nhiều so với kết quả của Otoi và cs. (1998; 85%); Chian và cs. (2004) dùng chất bảo quản lạnh là 15% EG kết hợp với 15% DMSO, và khi dùng 15% EG kết hợp với 15% PG cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tới 92%; Marató (2008; 82,4% khi dùng OPS và 91,00% khi dùng
cryotop) Riêng ở nƣớc ta, cho đến thời điểm này chỉ mới có công trình của Nguyễn Thị Thƣơng Huyền và cs. công bố về đông lạnh trứng bò với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông là 58,83%. Nhƣ vậy, tỷ lệ trứng sống sau giải đông khi sử dụng trong thí nghiệm của chúng tôi dựa vào hình thái là có thể chấp nhận đƣợc.
Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2
3.3. Kết quả nội dung 3
3.3.1. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1
Bảng 3.9. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP1
Số đạt
TN Số vi giọt
Sổ trứng
đem ĐL Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 8 68 477 74,34 ± 1,83% (354 trứng) 71,92 ± 2,20% (255 trứng) 53,70 ± 2,80% α<0,05
Biểu đồ 3.12. Kết quả thu hồi trứng chưa chín được bảo quản theo PP1
Sau 8 đạt thí nghiệm, trứng thu đƣợc sau rã đông (354/477) đạt tỷ lệ 74,34% ± 1,83 ; kết quả này thấp hơn một số công trình đã công bố ở nƣớc ngoài: 83,33% (Abdel Mohsen M. Hammam và cs., 2005); 99,30% (Vahida Anchamparuthy và cs., 2007). Nhƣ vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, có tới 25,66% trứng bị thất thoát sau rã đông (Biểu đồ 3.12). Lý giải cho điều này cũng giống nhƣ ở phần đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp vi giọt: chủ yếu do hơi nitơ che tầm nhìn làm sót các vi giọt. Tuy nhiên, hiện chƣa có công trình nào trong nƣớc công bố về tỷ lệ thu nhận trứng bò sau bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt. Do đó, kết quả bƣớc đầu chúng tôi đạt đƣợc có thể chấp nhận.
Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP1
Trứng sống sau rã đông (255/354) đạt tỷ lệ 71,92% ±2,20 % (Biểu đồ 3.13), kết quả này cao hơn công bổ của Hurtt và cs. năm 2000 với tỷ lệ trứng sống 46%. Tuy nhiên, nhóm tác giả Hurtt và cs. đánh giá tỷ lệ sống của trứng bằng phƣơng pháp nhuộm Hoechst 33342 trong khi nhóm chúng tôi đánh giá bằng quan sát hình thái. Khi so sánh tiếp với công bố của Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 98,9%); Dong-Hoon Kim và cs. (2007; 84%) thì rõ ràng kết quả của chúng tôi thấp hơn nhiều.
3.3.2. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2
Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2
Số đợt TN Số cọng rạ Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 7 70 365 71,72 ± 3,10% (262 trứng) 65,31 ± 2,69% (172 trứng) 47,16 ± 3,61% α<0,05
Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chưa chín được bảo quản theo PP2
Sau 7 đạt thí nghiệm, đã tiến hành đông lạnh đƣợc 365 trứng nhƣng chỉ thu đƣợc 262 sau rã đông đạt tỷ lệ 71,72% ± 3,10 . Kết quả này cũng thấp hơn một số công trình đã công bố ở nƣớc ngoài: Abdel Mohsen M. Hammam và cs. (2005; 83,33%); Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 99,30%). Qua đây, ta thấy tỷ lệ trứng thất thoát trong quá trình giải đông tới 28,28% (Biểu đồ 3.14).
Qua quá trình tiến hành thủy tinh hóa trứng trong cọng rạ, chúng tôi nhận thấy trứng mất chủ yếu ở giai đoạn rã đông: ngay khi lấy cọng rạ ra khỏi bình nitơ lỏng, một số cọng rạ thƣờng bị nổ do thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột. Lúc đó, toàn bộ trứng trong cọng rạ không thể thu hồi đƣợc. Ngoài ra, khi cắt cọng rạ để chuyển môi trƣờng chứa trứng ra đĩa thu thƣờng có hiện tƣợng bọt khí tạo ra rất nhiều, chính yếu tố này làm cản trở phần nào việc tìm và thu nhận trứng. Đây là khó khăn về kỹ thuật mà chúng tôi cần khắc phục.
Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi được bảo quản theo PP2
Trứng sống sau rã đông qua các đạt thí nghiệm là 172/262 trứng, đạt tỷ lệ 65,31% ±2,69 ; kết quả này cũng thấp hơn công bố của Vahida Anchamparuthy và cs. (2007; 98,9%); Dong-Hoon Kim và cs. (2007; 84%). Cũng tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp thủy tinh hóa vi giọt, số trứng chết nhiều sau đông lạnh ở phƣơng pháp này (34,69%) do một số nguyên nhân: chất lƣợng trứng không tốt, kỹ thuật tiến hành chƣa chuẩn, môi trƣờng chƣa đạt yêu cầu về các thông số pH, nồng độ
3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành theo 2 phương pháp thủy tinh hóa
Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành
Phƣơng pháp thủy tinh hóa
Sổ trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL PP1 477 74,34 ± 1,83% 71,92 ± 2,20% 53,70 ± 2,80% PP2 365 71,72 ± 3,10% 65,31 ± 2,69% 47,16 ± 3,61% Mức ý nghĩa α > 0,05 α > 0,05 α > 0,05
Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành
Kết quả Bảng 3.11. và Biểu đồ 3.16 cho thấy thấy:
- Tỷ lệ trứng thu đƣợc sau rã đông giữa hai phƣơng pháp không có sự khác biệt về thống kê (P > 0,05). Nhƣ vậy, cả hai phƣơng pháp đều có nguy cơ mất trứng sau rã đông nhƣ nhau. Nguyên nhân gây mất trứng ở mỗi phƣơng pháp đã đƣợc phân tích ở phần trên.
- Tỷ lệ trứng sống sau rã đông ở hai phƣơng pháp có khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05). Điều này chứng tỏ thủy tinh hóa trong vi giọt có tỷ lệ trứng sống sau rã đông cao hơn thủy tinh hóa trong cọng rạ. Kết quả chúng tôi thu đƣợc phù hợp với lý thuyết: đông lạnh vi giọt có tốc độ làm lạnh cực nhanh do môi trƣờng chứa trứng tiếp xúc trực tiếp với LN2, sự thủy tinh hóa diễn ra hoàn toàn nên tránh hình thành tinh thể đá nội và ngoại bào gây tổn thƣơng đến trứng. Trong khi đó, cọng rạ giữ trứng đã tạo một lớp cách nhiệt khi nhúng mẫu vào LN2, giảm phần nào tốc độ làm lạnh mẫu, sự thủy tinh hóa có thể không hoàn toàn gây ảnh hƣởng đến trứng nhiều hơn [Dinnyes, 2006].
3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ
Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau
Giai đoạn trứng đem ĐL Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL Chín 197 84,43 ± 1,84% 79,90 ± 2,33% 67,73 ±3,18% Chƣa chín 365 71,72 ±3,10% 65,31 ±2,69% 47,16 ±3,61% Mức ý nghĩa α < 0,05 α < 0,05 α < 0,05
Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau
Từ Bảng 3.12 và Biểu đồ 3.17 cho thấy việc bảo quản trứng bò đã đƣợc IVM cho kết quả tốt hơn trứng bò ở giai đoạn túi mầm (chƣa chín), tất cả sự khác biệt này đều có ý nghĩa về mặt thống kê (α < 0,05). Theo báo cáo của các nghiên cứu trên thế giới cho rằng bảo quản