7. Sản phẩm đề tài
1.3. Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng
1.3.1. Các phương pháp đông lạnh
Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thƣờng của trứng khi giảm nhiệt độ dƣới mức phản ứng hóa học bình thƣờng xảy ra (từ 37°C, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 1960c (nhiệt độ không sinh lý)).
Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng "equilibrium" với phƣơng pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng "nonequilibrium" với phƣơng pháp đông lạnh nhanh (rapid freezing) và phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đông lanh sử dụng. Tuy nhiên, bản chất của các phƣơng pháp này là giống nhau, cụ thể là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hƣởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nƣớc và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp.
❖ Phƣơng pháp thủy tinh hóa (Vitrification)
Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống nhƣ thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng nhƣ môi trƣờng bên ngoài trong quá trình làm lạnh. [50, 54]
Phƣơng pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đông lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phƣơng pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ƣu do không có tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phƣơng pháp thủy tinh hóa cải tiến đã đƣợc phát triển, có khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo quản. Phƣơng pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thƣơng do đông lạnh.
Trong phƣơng pháp thủy tinh hóa, tế bào cần đƣợc xử lí theo các bƣớc đông lạnh thông thƣờng nhƣ cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dịch đông lạnh nhanh một khoảng thời gian ngắn trƣớc khi đƣợc làm lạnh trong nitơ lỏng. Thời gian tiếp xúc trong dung dịch của phƣơng pháp thủy tinh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung dịch bảo vệ đông lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thấm của tế bào và độc tính của chất bảo quản lạnh chịu ảnh hƣởng rộng bởi nhiệt độ. Tế bào đƣợc huyền phù trong một dung dịch chất bảo quản thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng. Bởi vì sự hiện diện với nồng độ cao các chất bảo quản có khả năng gây độc cho tế bào nên trứng không đƣợc phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào đó chỉ đƣợc cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rất ngắn trƣớc khi chúng đƣợc nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. [48]
Khác với các phƣơng pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phƣơng pháp đông lanh cực nhanh, thể tích của dung dịch đông lạnh nhanh đƣợc giảm đến mức tối thiểu sử dụng nhiều công cụ khác nhau. Ví dụ, tế bào đƣợc đặt ở đầu loop hay đƣợc đặt dính ở ống bảo quản lạnh (cryotube hay cryoloop), ống mao dẫn mở (cọng rạ hở "open pulled straw"), hay đông lạnh không có dụng cụ chứa (vi giọt). Mục đích của phƣơng pháp này là làm lạnh và rã đông trứng với thể tích tối thiểu cần cho đông lạnh nhanh. Phƣơng pháp đông lạnh cực nhanh cũng đƣợc đƣa ra để cải tiến sự sổng sót của tế bào sau khi rã đông bởi vì nhiệt độ tới hạn có thể vƣợt qua nhanh chóng trƣớc khi tế bào bị tổn thƣơng. Tuy nhiên chất bảo quản đƣợc dùng trong kỹ thuật này có nồng độ rất cao, có khả năng gây nên những tổn thƣơng về cấu trúc di truyền cho tế bào. Có lẽ đây là lý do tại sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rất tốt khi nuôi trong ống nghiệm nhƣng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phôi vẫn còn rất thấp. Ngƣời ta cho rằng thành công của phƣơng pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo quản lạnh, cũng nhƣ thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trƣớc khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tƣợng chuyển dạng từ kính sang nƣớc đá. Hiện tại tuy chƣa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực
tế nhƣng tiềm năng của nó rất lớn vì tính đơn giản và những ƣu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm đang đƣợc sử dụng. [11, 13, 48]
1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA)
Các chất bảo quản lạnh đƣợc sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống nhƣ trong kỹ thuật đông lạnh chậm trƣớc đây, nhƣng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm một hoặc hai chất bảo quản lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nƣớc bên trong tế bào và một chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nƣớc bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. [11, 13]
1.3.2. 1. Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa
❖ Chất bảo quản lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (đƣợc sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2 - propanediol (PrOH).
• Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã đƣợc sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít ảnh hƣởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phôi nang và khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chóng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào. Sau khi đông lạnh trứng và phôi bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa bằng EG đã có sự mang thai bình thƣờng trên động vật và ngƣời. [11]
• Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO đƣợc phát hiện vào năm 1959 nhƣ là một chất bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhƣng tính độc của nó lại cao hơn ở nhiệt độ cao.
• Propylene glycol (PG): cũng là một chất tƣơng tự nhƣ glycerol, nhƣng nồng độ của nó đƣợc yêu cầu thấp hơn trong chất đông lạnh, và độc hơn glycerol.
❖ Chất bảo quản lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose.
Các saccharide khác nhau thƣờng đƣợc sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides. Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide nhƣ sucrose, ƣehalose và lactose. Những sucrose không thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nƣớc ra khỏi tế bào. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc nồng độ sucrose cao (1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã đƣợc xem là chất bổ sung của chất bảo quản đông lạnh rất có hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14]. Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme và màng tế bào. Trong một số trƣờng họp, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose. [11]
Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đòi hỏi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nồng độ cao để làm giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao có thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hóa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản đông lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đông. [54]
Trong thành phần môi trƣờng thủy tinh hóa hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng ethylene glycol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thƣờng là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm đƣợc khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm đƣợc độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60]
1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử
Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông. Chẳng hạn nhƣ những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trứng. Dung dịch bảo quản đông lạnh thƣờng đƣợc
tạo bằng cách thêm vào một lƣợng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trƣờng cấy giao tử và phôi.
❖ Dung dịch đệm
Dung dịch thủy tinh hóa là dung dịch chất bảo quản đông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp vói tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy môi trƣờng đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hóa là đệm muối photphat hay đệm HEPES.
❖ Các đại phân tử
Các hợp chất đại phân tử đƣợc thêm vào dung dịch chất bảo quản đông lạnh: polyvinylpirrolidone (PVP) nhƣng không thành công trong trong đông lanh phôi và gây độc cao đối với phôi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngoài ra, còn có các protein lớn gồm albumin huyết thanh bò - Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai -Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt -Thermal Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86]
Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lƣợng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tinh hóa. Thủy tinh hóa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll có khả năng đẩy mạnh thủy tinh hóa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đông lanh giống nhƣ thủy tinh hóa nội bào. Hơn nữa, các polymer có thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông.Vì thế, các đại phân tử hoạt động nhƣ chất thay thế ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó làm giảm độc cho tế bào. [55, 66]
1.3.3. Các yếu tổ ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa
Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thƣơng trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đó, tổn thƣơng lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thƣơng bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó (Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa tránh đƣợc sự hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) - ảnh hƣởng đến khả năng sống của trứng sau rã đông - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985; Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79,81]
Bên cạnh đó, phƣơng pháp thủy tinh hóa dƣờng nhƣ đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996). Ngoài ra, chất lƣợng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố nhƣ những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trƣởng thành của chúng, chất lƣợng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trƣởng thành, chất lƣợng và kích thƣớc trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hƣởng đến kết quả đông lạnh. [15,29]
Phƣơng pháp thủy tinh hóa đã đƣợc áp dụng trên phƣơng diện lâm sàng (Kuleshova và Lopata, 2002). Một vài điều cần lƣu ý có thể dẫn tới tỷ lệ thành công thấp là chất lƣợng nitơ lỏng, thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hƣởng chất bảo quản đông lạnh [37]
1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh ♦ Sự hình thành tinh thể đá ♦ Sự hình thành tinh thể đá
Sự hình thành tinh thể nƣớc đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nƣớc đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nƣớc đá hình thành có dạng sáu cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh đƣợc đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60]
Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá
Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.0000 C/giây, nƣớc nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nƣớc đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào. [55, 60]
Ở môi trƣờng đẳng trƣơng (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thƣờng đƣợc hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150
C. Tuy nhiên, tinh thể nƣớc đá chỉ đƣợc hình thành ở nhiệt độ -100C khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tƣợng thủy tinh hóa (vitrification). Hiện tƣợng này xảy ra khi trong môi trƣờng đông lạnh có các chất hòa tan cũng nhƣ các chất bảo quản có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thƣờng. [55, 60]
♦ Sự khử nƣớc
Sự khử nƣớc của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thông thƣờng các tế bào sẽ có thể bị tổn thƣơng ở nhiệt độ 15 đến -900C. Một khi tế bào không đƣợc khử nƣớc thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dƣới 00C. Tốc độ khử nƣớc của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nƣớc của màng, năng lƣợng hoạt hóa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tổ này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong xác định quá trình đông lạnh thích họp nhất.
♦ Độ pH của dung dịch
Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trƣờng biến đổi theo hƣớng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trƣờng dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo quản đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid -base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động nhƣ những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động nhƣ những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào đƣợc bảo quản. Ngƣời ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 00C với độ pH lớn hơn 9.
♦ Sự hình thành bọt khí
Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thƣơng và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nƣớc bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nƣớc đá thấp hơn tỷ trọng của nƣớc) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thƣớc của bọt khí thay đổi từ 25 - 100μm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lƣợng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh.
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trƣờng nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thƣơng cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thể đƣợc hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều