7. Sản phẩm đề tài
2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh
Chuẩn bị emzyme
- Eppendorf chứa Hyaluronidase 1mg/ml đƣợc ủ ấm ở 38,50C trƣớc khi sử dụng 2 giờ. - Đĩa Petri nhựa Φ35 chứa giọt môi trƣờng IVM1 ủ ấm trƣớc khi sử dụng 2 giờ.
Loại cumulus và quan sát
- Tạo giọt hyaluronidase trên đĩa Petri nhựa
- Sau 42 - 44 giờ nuôi cấy, sử dụng mouth pipette có gắn pipette Pasteur chuyển trứng vào giọt Hyaluronidase và vortex trong vòng 30 giây để loại bỏ cumulus.
- Các tế bào trứng sau khi loại cumulus gọi là các tế bào trứng trần sẽ đƣợc chuyển vào giọt môi trƣờng IVM1.
- Quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc, đánh giá sự trƣởng thành của trứng thông qua: sự đồng nhất về tế bào chất của trứng và sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
- Chỉ những trứng có tế bào chất đồng đều và có thể cực thứ nhất mới đƣợc sử dụng cho quá trình đông lạnh.
2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1)
Chuẩn bị
- Bình nitơ lỏng, cryotube, mouth pipette có gắn pipette Pasteur, hộp xốp chứa nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi
- Chuẩn bị 2 đĩa Petri nhựa 035: Đĩa số 1 chứa 100μ1 môi trƣờng VS1 (TCM-199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG), đĩa số 2 chứa 300μ1 môi trƣờng VS2 (TCM-199 10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose). Đặt 2 đĩa ở nhiệt độ phòng (250
C) khoảng 15 phút trƣớc khi sử dụng.
Tiến hành
- Sau khi IVM 42 - 44 giờ và đã loại bỏ cumulus, ta chọn những trứng có tế bào chất đồng đều và có thể cực thứ nhất chuyển vào đĩa số 1 (môi trƣờng VS1) để trong vòng 45 giây. Chuyển trứng sang đĩa số 2 (môi trƣờng VS2), dùng mouth pipette có gắn pipette Pasteur hút khoảng 5μl tạo vi giọt có chứa 5-7 trứng và nhỏ trực tiếp vào hộp xốp chứa nitơ lỏng trong vòng 25 giây. Lần lƣợt tạo vi giọt đông lạnh tất cả các trứng có đƣợc, sau đó dùng kẹp tìm và gắp các vi giọt cho vào cryotube (lƣu ý không bỏ sót vi giọt). Dùng bông nhét kín miệng cryotube và nhanh chóng chuyển cryotube vào bình chứa nitơ lỏng để bảo
Hình 2.5. Sơ đồ bổ trí đĩa vi giọt đông lạnh
Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN2
Hình 2.8. Chuyển vì giọt vào cryotube
2.1.5. Phương pháp giải đông các vi giọt được đông lạnh
Chuẩn bị
Chuẩn bị 1 đĩa nhựa Φ35 trống; 1 đĩa 4 giếng: giếng 1 chứa môi trƣờng RĐ1 (TCM- 199 + 10% FBS + 0,25M Sucrose), giếng 2 chứa môi trƣờng RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15M Sucrose), giếng 3 chứa môi trƣờng RĐ3 (TCM-199 + 10% FBS), giếng 4 chứa môi trƣờng IVM2 (dùng để đánh giá sống chết).
Tiến hành
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, sau đó cho vào bể ổn nhiệt 5 giây và chuyển môi trƣờng bên trong cọng rạ vào đĩa nhựa Φ35 trống. Chuyển trứng sang giếng số 1 của đĩa 4 giếng chứa môi trƣờng RĐ1, giữ khoảng 1,5 phút ở nhiệt độ phòng (250C). Chuyển trứng qua giếng số 2 chứa môi trƣờng RĐ2, giữ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục chuyển trứng vào giếng số 3 chứa môi trƣờng RĐ3, giữ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng sang giếng số 4 chứa môi trƣờng IVM2, để đánh giá sự sống chết của trứng.
Hình 2.9. Thao tác đổ vị giọt ra khỏi cryotube
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông
❖ Lƣu ý:
• Mỗi lần chuyển trứng sang các giọt môi trƣờng tƣơng ứng, trứng sẽ bị co lại vì vậy cần quan sát hình thái của trứng dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc để không bị mất mẫu.
2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2)
Chuẩn bị
Môi trƣờng VS1 :TCM-199 +10% FBS +10% DMSO +10% EG: dùng để cân bằng trứng
Môi trƣờng VS2: TCM-199 +10%FBS+20%DMSO+20% EG +1M Sucrose: dùng để bảo quản trứng ở -196°C
Cọng rạ 0,25ml (imv, Pháp), bình nhơ lỏng
Tiến hành
Sau 22 - 24h nuôi, chọn những trứng chín đem đông lạnh theo phƣơng pháp thủy tinh hóa (vitrification) 2 bƣớc: Trứng đang giữ trong môi trƣờng C3 sẽ đƣợc cân bằng trong môi trƣờng VS1 (TCM-199 + 10% FBS +10% DMSO + 10% EG) 45 giây, sau đó chuyển qua môi trƣờng VS2 (TCM-199 +10% FBS + 20% DMSO + 20% EG +1M Sucrose) trong 25 giây. Sau đó chuyển trứng vào cọng rạ (straw) trong vòng 30 giây.
Cách chuyển trứng vào cọng rạ nhƣ sau: hút 1 khoảng môi trƣờng VS2, sau đó hút một khoảng đệm khí, hút tiếp một đoạn môi trƣờng VS2 rồi dùng mouth pipette chuyển trứng vào (5-7 trứng/cọng rạ), hút thêm khoảng đệm khí, cuối cùng hút thêm một đoạn môi trƣờng VS2 (Hình 2.11) và hàn đầu cọng rạ bằng máy ép nhựa. Đƣa thẳng cọng rạ vào bình nitơ lỏng (thao tác nhanh).
Giải đông trứng
Trứng đƣợc rã đông theo 03 bƣớc. (Xem 2.1.4)
Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng, để trong không khí 5 giây, nhúng vào nƣớc ấm 33 - 350
C, dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt một đầu, rồi sau đó cắt đầu còn lại, chuyển trứng vào đĩa nhựa Φ35 trống.
Dùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trƣờng giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trƣờng RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trƣờng RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trƣờng nuôi trứng, để trong tủ nuôi (38,50C, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng đểDùng mouth pipette và pipette Pasteur hút trứng từ đĩa Φ35 chuyển qua môi trƣờng giải đông số 1 (RĐ1) trong khoảng 1,5 phút, chuyển trứng sang môi trƣờng RĐ2 (1,5 phút), chuyển trứng qua môi trƣờng RĐ3 (5 phút) ở nhiệt độ phòng. Sau cùng chuyển trứng vào đĩa chứa môi trƣờng nuôi trứng, để trong tủ nuôi (38,50
C, 5% CO2) khoảng 2-3 tiếng để giúp trứng hồi phục hoàn toàn trƣớc khi đánh giá sự sống chết của trứng.
Hình2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng
Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nước ấm
Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trường RĐ
2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng
- Trứng sống: mảng tế bào còn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và không bị co, không bị phân mảnh.
- Trứng chết: màng tế bào bị tổn thƣơng trong quá trình đông lạnh, nên tế bào chất bị co hoặc phân mảnh, màng tế bào có tể bị gãy.
2.2. Nội dung 2: Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) tinh hóa trong cọng rạ (PP2)
Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2
2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng
Xem 2.1.1
2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị Chuẩn bị
NaCl 0,9%: bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml (P7794, Sigma) và Streptomicin
0,1 mg/ml (S9137, Sigma). Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Giải đông trứng Đông lạnh trong cọng ra Đánh giá
Dung dịch D - PBS: môi trƣờng sử dụng để thu dịch nang trứng. Trƣớc khi sử dụng cần bổ sung kháng sinh Penicillin 100 IU/ml với Streptomicin 0,lmg/ml và ủ ấm ở 370C.
Môi trƣờng Flushing (FLUSH 050, FertiPro) (môi trƣờng W2): sử dụng để rửa trứng trƣớc khi IVM.
TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG + EGF (môi trƣờng C3): cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
Parafin lỏng (dầu khoáng) (Merck): dùng phủ vi giọt trong đĩa có tác dụng ngăn sự nhiễm, tránh làm bốc hơi vi giọt khi để lâu trong tủ ấm, đồng thời cố định và giúp ổn định các vi giọt.
Hyaluronidase (H4272, Sigma); dạng dung dịch đƣợc sử dụng để phá các tế bào cumulus quanh trứng khi đánh giá trứng sau khi IVM.
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mĩ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đƣờng kính 120μm, mouth pipette, bercher, erlen
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi soi nổi (độ phóng đại tối đa 40 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật)
❖ Thu nhận trứng
Thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút (Xem phần 2. 1 .2)
Việc phân loại trứng dựa vào độ dày của lớp tế bào cumulus; và chia thành 3 loại: A, B và C. Trong đó, trứng A và B còn lớp cumulus bám vào trứng và trứng C lớp cumulus bị bong một phần.
❖ Nuôi trứng trƣởng thành (In Vitro Maturation_IVM)
- Dùng mouth pipette thu những trứng loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từ đĩa D - PBS cho vào các giếng có môi trƣờng W2 và C3 để rửa.
- Sau đó cho khoảng 20 - 30 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng nuôi chứa môi trƣờng C3 (loại đĩa 4 giếng chứa 500 μl/giếng và phủ dầu khoáng). Nuôi trứng trong tủ ấm ở điều kiện 38,50C, 5% CO2, hơi nƣớc bão hòa. Lƣu ý: Môi trƣờng C3 cần ủ ấm 38,50C, 5% CO2 tối thiểu hai giờ trƣớc khi sử dụng.
- Sau 22 - 24h nuôi cấy, đánh giá sự trƣởng thành của trứng bằng cách tách bỏ lớp cumulus bằng mouth pipette và hyaluronidase. Trứng cho là trƣởng thành sẽ có 1 thể cực, tế bào chất sáng, đều, lớp cumulus giãn nở rộng
2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phương pháp 2
2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa pháp thủy tinh hóa
Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3
2.3.1.Thu nhận buồng trứng
Xem phần 2.1.1.
2.3.2.Thu nhận trứng
Xem phần 2.2.2 (Không tiến hành nuôi)
2.3.3.Đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 1 (Xem 2.1.4) Đông lạnh trứng trong cọng rạ (Xem 2.1.6)
Mẫu buồng trứng bò Thu và nuôi trứng Đông lạnh trong cọng rạ Đông lạnh trong vi giọt Đánh giá Giải đông trứng
2.3.4. Phương pháp giải đông
Giải đông trứng đông lạnh trong vi giọt (Xem 2.1.5) Giải đông trứng đông lạnh trong cọng rạ (Xem 2.1.6
2.4. Xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu đƣợc trong nghiên cứu đều đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel - 2007 với độ tin cậy 95%. Dùng hàm Descriptive Statistics, t-Test Two-Sample Assuming Equal Variances, t-Test Two- Sample Assuming Unequal Variances.
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả nội dung 1
3.1.1. Kết quả thu nhận trứng
Trứng heo đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chọc hút (Hình 3.1), kết quả thể hiện ở Bảng 3.1. và Biểu đồ 3.1.
Hình 3.1. Trứng heo được thu nhận từ buồng trứng (X100)
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo
Số đợt TN Số buồng
trứng Tổng trứng
Số
trứng buồng Loại A Loại B 10 80 1733 21,66 ± 0,27 41,68 ± 0,69%
(723 trứng)
27,37 ± 0,69% (474 trứng) α < 0,05
Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng
Tiến hành chọc hút 80 buồng trứng, thu đƣợc 1733 trứng các loại, nhƣ vậy trung bình thu đƣợc 21,66 trứng/buồng. Trong đó những trứng đƣợc chọn nuôi là các trứng loại A chiếm tới 41,68% (723 trứng) và loại B đạt 23,37% (474 trứng), còn lại 34,95% (536 trứng) là trứng loại C. Ở đây tỷ lệ trứng loại C khá cao vì thông thƣờng lớp cumulus bao quanh trứng heo rất lỏng lẻo, dễ bị bong ra nếu dùng lực hút và đẩy mạnh. Chính vì vậy, thao tác thu nhận trứng đòi hỏi phải điều chỉnh lực đẩy của xi lanh để hạn chế trứng xấu. Bên cạnh đó, vì nguồn mẫu buồng trứng thu nhận từ lò mổ nên có thể chất lƣợng mẫu không đảm bảo sự tƣơng đồng về các chỉ tiêu cần thiết: tuổi buồng trứng, chất lƣợng buồng trứng, kích thƣớc nang trứng
3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM)
Những trứng loại A và B đem nuôi cấy qua 2 môi trƣờng VM1 và VM2 nhƣ đã trình bày ở trên. Sau 44 giờ, thu và vortex trứng bằng hyaluronidase 0,1% để loại cumulus nhằm quan sát thể cực (Hình 3.2). Thí nghiệm đƣợc tiến hành 10 đạt, kết quả ghi nhận ở Bảng 3.2. và Biểu đồ 3.2.
Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất
Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo
Số đợt TN Số trứng đem nuôi Tỷ lệ trứng chín
10 1189 65,42 ± 0,79%
(779 Trứng) α < 0,05
Sau 10 lần thí nghiệm, tổng số đã chọn đƣợc 1189 trứng tốt dùng để nuôi. Sau 44 - 48 giờ nuôi cấy, có 779/1189 trứng chín, đạt tỷ lệ trung bình 65,42 ± 0,79%. Tỷ lệ này khá cao so với tác giả Huỳnh Thị Lệ Duyên (2004) chỉ đạt 18,3%. Đồng thời khi so sánh với một số kết quả đƣợc công bố trên thế giới thì thấy kết quả IVM trứng heo của chúng tôi cũng không có sự cách biệt mấy: Abeydeera Lalantha R. và cs. (1998, 80 - 85%); Kazuhiro và cs. (1999) là 68%; Yamauchi và cs. (1999, 60 - 70%); Marques và cs. (2006) là 65%; Maedomari (2007, 64,5%). Tuy nhiên, kết quả này thấp so với các tác giả khác trên thế giới nhƣ: Iwamoto (2005, 73,00%). Tỷ lệ trứng chín thấp hơn nhƣ thế là do các nguyên nhân sau:
- Địa điểm lấy mẫu nằm cách xa phòng thí nghiệm và thu mẫu vào đêm khuya (24giờ) nên thời gian vận chuyển mẫu về nơi xử lý khá lâu. Bên cạnh đó, dụng cụ ổn nhiệt trong quá trình thu mẫu do đƣợc tự chế nên không đảm bảo hệ thống ổn nhiệt trong quá trình vận chuyển mẫu. Hai yếu tố này ảnh hƣởng gián tiếp đến tỷ lệ sống, chết và sự trƣởng thành của trứng trong quá trình nuôi cấy.
- Mẫu buồng trứng thu nhận từ lò mổ nên không biết rõ độ tuổi, yếu tố di truyền của con giống. Các trứng thu nhận từ buồng trứng có thể ở nhiều giai đoạn khác nhau của sự phát triển nên khả năng trƣởng thành của trứng diễn ra không đồng thời tại một thời điểm.
- Thao tác thu nhận trứng bằng phƣơng pháp chọc hút cũng tác động không tốt đến trứng vì chọc hút bằng kim 18G gây áp lực hút quá mạnh làm mất tính liên kết của phức hợp trứng - cumulus (Cumulus - Oocyte Complex_COC) ảnh hƣởng khả năng trƣởng thành của trứng. Thao tác chuyển trứng bằng hệ thống mouth pipette và pipette Pasteur còn chậm làm cho trứng phải tiếp xúc trực tiếp với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, ánh sáng trong khoảng thời gian dài. Chính các lý do này cũng góp phần vào việc ảnh hƣởng đến tỷ lệ trƣởng thành của trứng.
- Bên cạnh đó, do điều kiện phòng thí nghiệm không cho phép, kết quả là thời gian thực hiện IVM quá lâu nên trứng một phần nào bị thoái hóa. Ngoài ra, chính tác nhân enzyme hyaluronidase, tác động cơ học bằng máy vortex và việc hút rửa loại cumulus và enzyme bằng pipette Pasteur đã tác động xấu đến trứng vì màng tế bào động vật rất mỏng manh, đặc biệt là màng tế bào trứng.
3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1
Sử dụng số trứng metaphase II có xuất hiện thể cực đã thu nhận đƣợc từ các thí nghiệm trên, tiến hành quy trình đông lạnh và giải đông theo trình tự các bƣớc; ghi nhận kết quả trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1
Số đợt TN Số vi giọt Số trứng đem ĐL Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ sống thu hồi Tỷ lệ sống số trứng ĐL 8 43 305 68,25 ± ,81% (216 trứng) 46,15 ± 5,63% (91 trứng) 29,92 ± 2,82% α < 0,05 ❖ Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành 8 đạt thí nghiệm với tổng số trứng đem đông lạnh là 305 trứng. Tỷ lệ trứng thu hồi sau giải đông đạt 68,25 ± 6,81%. Có tới 31,75% trứng bị thất thoát trong quá trình giải đông (Biểu đồ 3.3). Điều này có thể đƣợc lý giải nhƣ sau:
Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1
- Vi giọt đông lạnh có thể tích rất nhỏ và hơi lạnh của nitơ làm hạn chế tầm nhìn nên dẫn đến việc rất dễ sót một số vi giọt có chứa trứng trong hộp đựng nitơ lỏng. Chính điều này làm cho khả năng bỏ sót trứng trong quá trình thu nhận vi giọt vào cryotube rất cao.
- Môi trƣờng thủy tinh hóa VS1 và VS2 có nồng độ các chất bảo quản cao dần làm cho hai dung dịch này có độ nhớt đặc trƣng, đặc biệt là môi trƣờng VS2 Việc này gây khó khăn cho quá trình thu nhận trứng vì chiết suất của môi trƣờng thay đổi liên tục làm cho việc quan sát trứng dƣới kính hiển vi rất khó kiểm soát. Bên cạnh đó, giới hạn về thời gian xử lý trứng trong các môi trƣờng thủy tinh hóa rất ngắn (45 giây trong VS1 và 25 giây trong VS2) nên việc bỏ sót trứng là không thể tránh khỏi.
- Chất bảo quản đông lạnh có tính thấm cao có thể gây ra sự thay đổi lớn về thể tích tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và giải đông. Bên cạnh đó, môi trƣờng ngoại bào sẽ trở nên ƣu trƣơng hơn bởi vì nồng độ chất tan tăng lên so với nồng độ môi trƣờng nội bào. Vì thế nƣớc sẽ rời khỏi tế bào và kết quả là tế bào co lại. Đây chính là lý do trứng thƣờng bị mất ở