7. Sản phẩm đề tài
1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh
♦ Sự hình thành tinh thể đá
Sự hình thành tinh thể nƣớc đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tế bào trong đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nƣớc đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nƣớc đá hình thành có dạng sáu cạnh, hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu khi tốc độ làm lạnh đƣợc đẩy lên (Hình 2.4). [55, 60]
Hình 1.4. Ảnh hưởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá
Với tốc độ làm lạnh đạt đến 20.0000 C/giây, nƣớc nguyên chất tạo băng vô định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nƣớc đá từ nhỏ đến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào. [55, 60]
Ở môi trƣờng đẳng trƣơng (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thƣờng đƣợc hình thành ở nhiệt độ -5 đến -150
C. Tuy nhiên, tinh thể nƣớc đá chỉ đƣợc hình thành ở nhiệt độ -100C khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Tuy nhiên, ở nhiệt độ khoảng -1300C, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tƣợng thủy tinh hóa (vitrification). Hiện tƣợng này xảy ra khi trong môi trƣờng đông lạnh có các chất hòa tan cũng nhƣ các chất bảo quản có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thƣờng. [55, 60]
♦ Sự khử nƣớc
Sự khử nƣớc của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Thông thƣờng các tế bào sẽ có thể bị tổn thƣơng ở nhiệt độ 15 đến -900C. Một khi tế bào không đƣợc khử nƣớc thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dƣới 00C. Tốc độ khử nƣớc của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nƣớc của màng, năng lƣợng hoạt hóa của tính thấm và tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V). Những yếu tổ này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong xác định quá trình đông lạnh thích họp nhất.
♦ Độ pH của dung dịch
Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trƣờng biến đổi theo hƣớng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trƣờng dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo quản đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid -base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động nhƣ những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động nhƣ những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lý của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào đƣợc bảo quản. Ngƣời ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 00C với độ pH lớn hơn 9.
♦ Sự hình thành bọt khí
Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thƣơng và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá. Thể tích nƣớc bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỷ trọng của nƣớc đá thấp hơn tỷ trọng của nƣớc) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thƣớc của bọt khí thay đổi từ 25 - 100μm và tỷ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lƣợng bọt khí tỷ lệ thuận với tốc độ làm lạnh.
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trƣờng nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thƣơng cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thể đƣợc hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trƣờng sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trƣờng PBS có thể hạn chế số lƣợng bọt khí. [7, 9]