7. Sản phẩm đề tài
1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử
Dung dịch chất bảo quản chứa nhiều hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông. Chẳng hạn nhƣ những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trứng. Dung dịch bảo quản đông lạnh thƣờng đƣợc
tạo bằng cách thêm vào một lƣợng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trƣờng cấy giao tử và phôi.
❖ Dung dịch đệm
Dung dịch thủy tinh hóa là dung dịch chất bảo quản đông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp vói tốc độ làm lạnh cao. Vì vậy môi trƣờng đệm cơ bản sử dụng cho thủy tinh hóa là đệm muối photphat hay đệm HEPES.
❖ Các đại phân tử
Các hợp chất đại phân tử đƣợc thêm vào dung dịch chất bảo quản đông lạnh: polyvinylpirrolidone (PVP) nhƣng không thành công trong trong đông lanh phôi và gây độc cao đối với phôi (Wilmut và Rowson, 1973). Polyethylene glycol (PEG) cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất bổ sung (Rall và Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), Ficoll. Ngoài ra, còn có các protein lớn gồm albumin huyết thanh bò - Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai -Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biến khác là các protein giảm nhiệt -Thermal Hysteresis Proteins (THPs). [55, 66, 86]
Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lƣợng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tinh hóa. Thủy tinh hóa ngoại bào cần nồng độ chất bảo quản cao hơn nội bào. Việc thêm polymer có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Ficoll có khả năng đẩy mạnh thủy tinh hóa ngoại bào với nồng độ chất bảo quản đông lanh giống nhƣ thủy tinh hóa nội bào. Hơn nữa, các polymer có thể tạo ra chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông.Vì thế, các đại phân tử hoạt động nhƣ chất thay thế ngoại bào để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó làm giảm độc cho tế bào. [55, 66]
1.3.3. Các yếu tổ ảnh hưởng đến chất lượng trứng sau khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa
Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thƣơng trong cấu trúc và chức năng của trứng. Trong đó, tổn thƣơng lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích. Trứng dễ bị tổn thƣơng bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào. Vì vậy, việc đông lạnh chúng là rất khó (Vincent và Johnson, 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa tránh đƣợc sự hình thành đá nội bào (Intracellular Ice Formation_IIF) - ảnh hƣởng đến khả năng sống của trứng sau rã đông - nhờ thay đổi thành phần nội bào từ pha lỏng sang pha rắn (Rall và Fahy, 1985; Vajta và Kuwayama, 2006). [66, 79,81]
Bên cạnh đó, phƣơng pháp thủy tinh hóa dƣờng nhƣ đe dọa đến sự sống sau đông lạnh do nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao và yếu tố nhiệt độ thực hiện có thể gây độc cho tế bào (Hotamisligil và cs., 1996). Ngoài ra, chất lƣợng trứng sau thủy tinh hóa còn phụ thuộc các yếu tố nhƣ những biến đổi hình dạng, cấu trúc của trứng do quá trình đông lạnh và rã đông gây ra; đặc điểm và giai đoạn phát triển của trứng thực hiện đông lạnh (Bernard A. và Fuller B.J., 1996). Kết quả của nhiều nghiên cứu về sự sống của trứng sau đông lạnh có thể bị tác động bởi trạng thái trƣởng thành của chúng, chất lƣợng hay các yếu tố lý sinh trong quy trình đông lạnh đã sử dụng. Ví dụ, khi trƣởng thành, chất lƣợng và kích thƣớc trứng là đặc điểm quan trọng ảnh hƣởng đến kết quả đông lạnh. [15,29]
Phƣơng pháp thủy tinh hóa đã đƣợc áp dụng trên phƣơng diện lâm sàng (Kuleshova và Lopata, 2002). Một vài điều cần lƣu ý có thể dẫn tới tỷ lệ thành công thấp là chất lƣợng nitơ lỏng, thời gian thao tác, tốc độ đông lạnh, ảnh hƣởng chất bảo quản đông lạnh [37]