7. Sản phẩm đề tài
1.3.2. 1 Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa
❖ Chất bảo quản lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (đƣợc sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2 - propanediol (PrOH).
• Ethylene glycol (EG): Phổ biến nhất và đã đƣợc sử dụng trong quy trình thủy tinh hóa. Chất này ít ảnh hƣởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua màng, độc tính của nó sẽ xuất hiện vào khoảng 38oC. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phôi nang và khuếch tán nhanh, cân bằng nhanh chóng với tế bào qua màng trong suốt và màng tế bào. Sau khi đông lạnh trứng và phôi bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa bằng EG đã có sự mang thai bình thƣờng trên động vật và ngƣời. [11]
• Dimethyl sulfoxide (DMSO): DMSO đƣợc phát hiện vào năm 1959 nhƣ là một chất bảo quản hiệu quả. Chất này xuyên qua màng dễ dàng hơn glycerol nhƣng tính độc của nó lại cao hơn ở nhiệt độ cao.
• Propylene glycol (PG): cũng là một chất tƣơng tự nhƣ glycerol, nhƣng nồng độ của nó đƣợc yêu cầu thấp hơn trong chất đông lạnh, và độc hơn glycerol.
❖ Chất bảo quản lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose.
Các saccharide khác nhau thƣờng đƣợc sử dụng, bao gồm mono-, di- và trisaccharides. Các monosaccharide gồm fructose, glucose, và galactose. Các disaccharide nhƣ sucrose, ƣehalose và lactose. Những sucrose không thấm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nƣớc ra khỏi tế bào. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc nồng độ sucrose cao (1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và cs., 1999) [37]. Trahelose đã đƣợc xem là chất bổ sung của chất bảo quản đông lạnh rất có hiệu quả (Begin và cs., 2003) [14]. Cả sucrose và trehalose ức chế màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ bền của enzyme và màng tế bào. Trong một số trƣờng họp, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơn cả sucrose. [11]
Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đòi hỏi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nồng độ cao để làm giảm tinh thể đá. Kết quả là với nồng độ cao có thể dẫn đến sốc thẩm thấu và gây độc hóa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nồng độ cao: (i) Giảm bớt chất bảo quản đông lạnh, (ii) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đông. [54]
Trong thành phần môi trƣờng thủy tinh hóa hiện nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng ethylene glycol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thƣờng là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm đƣợc khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm đƣợc độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. [60]