C. Chồi tạo ủược trờn cụng thức ủối chứng (khụng cảm ứng).
5.KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
1. Trong bốn loại mụi trường cơ bản dựng ủể thử nghiệm nuụi cấy in vitro cõy thụng nhựa, mụi trường M16 (Pullman và cộng sự, 2003) phự hợp nhất với tốc ủộ tăng trưởng chiều cao thõn tới 2,7 cm sau 10 tuần nuụi cấy.
2. đó tỏi sinh thành cụng cõy thụng nhựa in vitro thụng qua ủa chồi từ hai loại nguyờn liệu phụi hạt chớn và cõy mầm.Với phụi hạt chớn nguyờn ven: thời gian cảm ứng là 6 ngày, nồng ủộ BAP tối ưu cho tạo ủa chồi là 9 mg/l (tỷ lệ tạo ủa chồi 61,5%, số chồi trung bỡnh 12,2 chồi/ mẫu cấy). Với nguyờn liệu cõy mầm: mụi trường M16 bổ sung 6 mg/l BAP thớch hợp cho việc tạo ủa chồi (tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi ủạt 73,5 %, số chồi trung bỡnh là 7,6 chồi/ mẫu cấy).
3. đó xỏc ủịnh ủược mụi trường nhõn nhanh cõy thụng nhựa in vitro. Mụi trường phự hợp khi sử dụng ủoạn thõn là M16 bổ sung 7mg/l BAP (tỷ lệ tạo ủa chồi ủạt 76,3 %, số chồi trung bỡnh là 5,5 chồi / mẫu cấy). Mụi trường phự hợp cho ủỉnh chồi là M16 bổ sung 5 mg/l BAP (tỷ lệ mẫu tạo ủa chồi 84,5 %, số chồi trung ủạt 8,5 chồi/ mẫu cấy).
4. Mụi trường tạo rễ hiệu quả là M16 bổ sung 1 mg/l BAP (tỷ lệ tạo rễủạt 68,9 %). Giỏ thể ra cõy thớch hợp gồm cỏt vàng Ờ trấu hun với tỷ lệ 1:1 (tỷ lệ cõy sống sút 72,5 %). Việc sử dụng NAA riờng rẽ hay kết hợp với IBA ủều khụng mang lại hiệu quả tạo rễ cõy thụng nhựa.
5. đó xỏc ủịnh ủược ngưỡng nồng ủộ chất chọn lọc và thử nghiệm chuyển gen
gus vào cõy thụng nhựa như sau: Nồng ủộ 6 mg/l PPT hoặc 4 mg/l hygromycine phự hợp cho chọn lọc cõy thụng nhựa chuyển gen. Thời gian siờu õm 30 giõy làm tăng tỷ lệ biểu hiện của gen gus ủối với nguyờn liệu là phụi hạt chớn nguyờn vẹn (tỷ lệ biểu hiện ủạt 68,3% so với ủối chứng là 5,5%). Cõy mầm 3 tuần tuổi thớch hợp làm nguyờn liệu cho chuyển gen chuyển gen (tỷ lệ biểu hiện gen gus là 74,7%).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ58
5.2 Kiến nghị
Tiếp tục hoàn thiện hệ thống nuụi cấy, tỏi sinh cõy và ủỏnh giỏ hoạt ủộng của gen gus từ cỏc dũng cõy thu ủược trong cỏc thớ nghiệm chuyển gen. Quy trỡnh tỏi sinh cõy thụng qua ủa chồi từ phụi hạt chớn và cõy mầm in vitro ủó xõy dựng cú thể sử dụng cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen hữu ớch vào cõy thụng nhựa.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999), ỘNghiờn cứu cỏc phương phỏp nhõn nhanh một số giống hoa cỳc chựy Hà LanỢ, Hội nghị
Cụng nghệ sinh học toàn quốc 1999, tr. 859-865.
2. Nguyễn Duy Chiến (2005), Lạng Sơn: Sõu rúm thụng phỏ hoại 2.900 ha rừng.
http://vietbao.vn/Xa-hoi/Lang-Son-Sau-rom-thong-pha-hoai-2.900-ha-rung. 3. Hà đồng (2006), Thanh Hoỏ: Gần 10.000 ha rừng thụng bị sõu rúm tàn phỏ.
http://vietbao.vn/Xa-hoi/Thanh-Hoa-Gan-10000-ha-rung-thong-bi-sau-rom- tan-pha.
4. đỗ Xuõn đồng, Bựi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Nụng Văn Hải, Chu Hoàng Hà (2008), ỘNghiờn cứu hệ thống tỏi sinh cõy xoan ta (Melia azedarach L) thụng qua phụi soma từ thõn mầm phục vụ chuyển genỢ, Tạp chớ Cụng nghệ
sinh học, 6(2), tr. 227-232.
5. Lờ Tấn đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), ỘTạo cõy Hụng (Paulownia fortune) chuyển gen khỏng sõu thụng qua Agrobacterium tumefaciensỢ, Hội nghị Cụng nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 1088-1090.
6. Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuõn Thương, Kiều Nam Phương, Bựi Văn Lệ (2003), ỘBước ủầu nhõn nhanh giống thụng Caribe (Pinus caribaea) bằng phương phỏp nuụi cấy in vitroỢ. Hội nghị Cụng nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 880-884.
7. Trần Thị Cỳc Hũa, Lờ Trần Bỡnh, Bựi Bỏ Bổng (2004), ỘChuyển nạp gen khỏng sõu cryIAb và cryIAc vào cỏc giống lỳa bằng phương phỏp Agrobacterium
và chọn lọc MannoseỢ, Nụng nghiệp-Nụng thụn-Mụi trường, (6), tr. 21-26.
8. Hoàng Kỹ (2009), Sõu rúm thụng gặm nhấm 3000 ha rừng thụng
http://dantri.com.vn/c20/s20-313850/sau-rom-gam-nham-gan-3000-ha-rung- thong.htm.
9. Trần Cụng Loan, Nguyễn Thế Nhó (1997), Cụn Trựng Rừng. NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ60
10. Quang Long và Phan Sỏng (2005), đại Dịch Sõu Rúm Lại Bựng Phỏt
http://vietbao.vn/Xa-hoi/Dai-dich-sau-rom-lai-bung-phat-o-Nghe-An.
11. Lờ đỡnh Lương (2002), Nguyờn lý kỹ thuật di truyền. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. đoàn Thị Mai, Lờ Sơn, Lương Thị Hoan, Lờ Trần Bỡnh, đinh Thị Phũng, Lờ Thị Muội (2003), ỘNhõn giống một số loài cõy trồng rừng cú năng suất, chất lượng cao bằng phương phỏp nuụi cấy mụỢ, Hội nghị Cụng nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 910 - 914.
13. Ló Tuấn Nghĩa, Vũđức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng cụng nghệ gen trong chọn tạo giống cõy trồng, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội. 14. Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Phương Thảo (1999),
ỘNghiờn cứu xõy dựng quy trỡnh nhõn giống cõy hoa loa kốn bằng kỹ thuật tạo củ trong ống nghiệmỢ, Hội nghị Cụng nghệ sinh học toàn quốc 1999, tr.
866-873.
15. đỗ Tiến Phỏt, đinh Thị Phũng, Chu Hoàng Hà (2008), Ộđỏnh giỏ ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gene vào cõy bụng (Gossypium
hirsutum L) thụng qua Agrobacterium tumefaciensỢ, Tạp chớ Cụng nghệ
sinh học, 6(4A), tr. 689-695.
16. đinh Thị Phũng, Lờ Xuõn đắc, Lờ Trần Bỡnh, Lờ Thị Muội (2000), ỘKết quả tạo giống lỳa DR2, DR3 phự hợp cỏc vựng trung du, miền nỳi và vựng ủất bạc màuỢ, Kỷ yếu Hội nghị KHCN và mụi trường khu vực Bắc Trung Bộ lần thứ
V, tr. 51 - 56.
17. Chu Bỏ Phỳc, Phạm Thị Kim Hạnh, Phạm Thị Trang, Nguyễn Thị Liờn, Nguyễn Bảo Ngọc, đỗ Năng Vịnh (2003), ỘNghiờn cứu nhõn nhanh một số cõy thõn gỗ thụng qua hệ thống tỏi sinh mụ sẹo phụi húa và nhõn chồi in vitro (Tếch, Trầm, Hụng, Bạch ủàn)Ợ, Hội nghị Cụng nghệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 939 - 943.
18. Phan Sỏng (2005), Sõu rúm lại tàn phỏ rừng thụng
http://vietbao.vn/Xa-hoi/Nghe-An-Sau-rom-lai-tan-pha-rung-thong.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ61
chồi cõy thụng nhựa (Pinus merkusii) phục vụ chuyển gen. Khúa luận tốt nghiệp, đHNN Hà Nội 2008.
20. Nguyễn Thị Tõm, đinh Thị Phũng, Lờ Trần Bỡnh (1999), ỘỨng dụng Cụng nghệ Tế bào thực vật vào việc chọn dũng chịu núng ở lỳaỢ, Hội nghị Cụng nghệ
sinh học toàn quốc 1999, tr. 819-826.
21. Nguyễn đức Thành (2000), Nuụi cấy mụ tế bào thực vật Ờ Nghiờn cứu và ứng dụng. NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
22. Nguyễn đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 23. Lờ Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội.
24. Hà Huy Thịnh (1999), Nghiờn cứu xõy dựng phương phỏp vi trớch vào chọn giống Thụng nhựa (Pinus merkusii) cú lượng nhựa cao. Luận ỏn tiến sĩ Nụng nghiệp, Viện khoa học Lõm nghiệp Việt Nam.
25. Hà Huy Thịnh (2004), Xõy dựng mụ hỡnh rừng trồng Thụng nhựa cú lượng nhựa cao bằng nguồn giống cú chất lượng di truyền ủược cải thiện.
http://dof.mard.gov.vn/khoahoc_index.aspx.
26. Phạm Thị Võn, Nguyễn Văn Bắc, Lờ Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lờ Trần Bỡnh (2008), ỘTạo cõy thuốc lỏ khỏng bệnh khảm dưa chuột bằng ký thuật RNAiỢ, Cụng nghệ sinh học, 6(4A), tr. 679-687.
27.Thành Vinh (2005), Sõu rúm dày ủặc trờn hơn 1.000 hộc-ta rừng thụng
http://www.khoahoc.com.vn/doisong/moi-truong/thien
nhien/1105_Sau_rom_day_dac_tren_hon_ 1_000_hec_ta_rung_thong.aspx.
Tiếng Anh
28.Alida B, Magdalena C and Leandro P (2008), ỘEvalution of selection strategies alternative to nptII in genetic transformation of CitrusỢ, Plant cell rep, (27), pp. 1005-1015.
29.Bishop H, Zabkiewicz R.J, Grace L, Gardner R.C, Wagner A and Walter C (2001), ỘConifer genetic engineering: transgenic Pinus radiata and Picea abies plant
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ62 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30.Boscariol R.L, Almeida W.A.B, Derbyshire M.T.V.C, Filho F.A.A and Mendes B.M.J (2003), ỘThe use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck)Ợ, Plant cell rep,
(22), pp. 122-128.
31.Bozhkov P.V, Filonova L.H and Arnold S.V (2002), ỘA key developmental switch during Norway spruce somatic embryogenesis is induced by withdrawal of growth regulators and is associated with cell death and extracellular acidifacationỢ, Biotech and bioeng, (77), pp. 658-667.
32.Briew L.O and Henrry R.J (2000), ỘTransgenic Cereal, American Asssociation of Cereal Chemist St. PaulỢ, Minnesota, USA, pp. 649 Ờ 656.
33.Brukhin V, Clapham D, Elfstrand M and Arnol S.V (2000), ỘBasta tolerance as a selectable and screening marker for transgenic plant of Narway spruceỢ,
Plant Cell Rep, (19), pp. 889-903.
34.Charity H.L, Donaldson S.S, Grace L and Walter C (2002), ỘAgrobacterium- mediated transformation of Pinus radiata organogenic tissue using vacuum- infiltrationỢ, Plant Cell, Tis and Org Cul, (70), pp. 51-60.
35.Cloudio S and Edward C (2003), ỘRecent advances in conifer somatic embryogenesis: improving somatic embryo qualityỢ, Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, (74), pp. 15-35.
36.DeClercq J, Zambre M, Van M.M, Dillen W and Angenon G (2002), ỘAn optimized Agrobacterium - mediated transformation procedure for
Phageolus acutifolius A.GrayỢ, Plant Cell Rep, (21), pp. 333 Ờ 340.
37.Ding Z.S, Zhao M, Jing Y.X, Li L.B and Kuang T.Y (2006), ỘEfficient
Agrobacterium Ờ Mediated transformation of Rice by Phosphomannose
Isomerase/Mannose selectionỢ, Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp. 295-303.
38.Ditt R.F, Nester E.W and Comai L (2005) ỘThe plant cell defense and Agrobacterium
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ63
39.Ellis D.D, McCabe D.E, Mcinnis S, Ramachandran R, Russell D.R, Wallace K.M, Martinell B.J, Roberts D.R, Raffa K.F and McCown B.H (1993), ỘStable transformation of Picea glauca by particle accelerationỢ Biotechnology,
(11), pp. 84Ờ89.
40.Emilio M, Yoshihisa H and Katsuaki I (2005), Somatic embryo production and plant regeneration of Japanese black pine (Pinus thunbergii). J For Res
10:403Ờ407.
41.FAO (2004), A global study on the state of forest tree genetic modification.
42.Francisca C, Felipe A, Marlene G, Consuelo M and Patricio A.J (2002), ỘStable transformation of pinus radiata embryogenic tissue by Agrobacerium tumefaciens, plant cellỢ, Tis and Org Cul, (70), pp. 251-257.
43.Francisco S, William D, Jeffrey K.D and Trevor A.T (1996) ỘIn vitro regeneration of plantlets from mature embryos of Pinus ayacahuiteỢ, Tree Physiology, (17), pp. 787-796.
44.Gelvin S.B (2003), ỘAgrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the ỘGene - jockeyingỢ ToolỢ, Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 67(1), pp. 16-37.
45.Gould J.H, Zhou Y.X, Padmanabhan V, Magallanes-Cedeno M.E and Newton RJ (2002), ỘTransformation and regeneration of loblolly pine: shoot apex
inoculation with AgrobacteriumỢ, Mol Breed, (10), pp. 131Ờ141.
46.Huang Y, Diner A.M and Karnosky D.F (1991), ỘAgrobacterium rhizogenes- mediated genetic transformation and regeneration of a conifer: Larix deciduaỢ In Vitro Cell Dev Biol, (27), pp. 201Ờ207.
47.Humara M, Lopez M and Ordas R.J (1999), ỘAgrobacterium tumefaciens- mediated transformation of Pinus pinea L. cotyledons: an assessment of factors influencing the efficiency of uidA gene transferỢ, Plant Cell Reports (19), pp. 51Ờ58.
48.Jean H.G, Yuan X.Z, Veeraragavan P, Maria E.M and Ronald J.N (2002), ỘTransformation and regeneration of loblolly pine: shoot apex inoculationỢ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ64
49.Jefferson R.A (1987), ỘAsaying chimeric gens in plants: The gus gen fusiuon
systemỢ, Plant Molecular Biology Reporter, (5), pp. 387-405.
50.Juliana D, Annika P, Jurith M and Iris S (2006), ỘThe use of the phosphomannose- isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plantsỢ,
Plant Cell Rep (25), pp. 1149Ờ1156.
51.Klimaszewska K, Lachance D, Pelletier G, Lelu M.A and Seguin A (2001), ỘRegeneration of transgenic Picea glauca, P. mariana and P. abies after
cocultivation of embryogenic tissue with Agrobacterium tumefaciensỢ, In Vitro Cell Dev Biol Plant, (37), pp. 748Ờ755.
52.Konstantin A.S, Roman V.M and Sergey V.D (2003), ỘPlantlet regeneration from subculturable nodular callus of Pinus radiataỢ Plant Cell, Tis and Org Cul (72), pp. 139Ờ146.
53.Le VQ, Belles-Isles J, Dusabenyagasani M and Tremblay F.M (2001), ỘAn improved procedure for production of white spruce (Picea glauca) transgenic plants using Agrobacterium tumefaciensỢ, J Exp Bot, (52), pp.
2089Ờ2095.
54.Lin X, Wenbo Z, Katsuaki T, Susumu T, Kanji O and Hiroyoshi T (2005), ỘStable genetic transformation of Larix gmelinii L. by particle bombardment of
zygotic embryosỢ, Plant Cell Rep, (24), pp. 418Ờ425.
55.Lining T and Armand S (2004), ỘMicroprojectile Particle Effect on Stable Transformation of Black Spruce Via BombardmentỢ, Plant Molecular Biology Reporter, (22), pp. 199Ờ199.
56.Lynette J.G, Julia A.C, Charity B.G, Nod K and Christian W (2005), ỘInsect- resistant transgenic Pinus radiataỢ. Plant Cell Rep, (24), pp. 103-111. 57.Maruyama E, Hosoi Y and Ishii K, (2005), ỘSomatic embryo production and plant
regeneration of Japanese black pine (Pinus thunbergii)Ợ, J For Res, (10), pp. 403Ờ407.
58.McCown BH and Lloyd C (1981), ỘWoody plant medium (WPM) A revised mineral nutrient formulation for microculture of woody plant speciesỢ.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ65
59.Murashige T and Skoog F (1962) ỘA revised medium for rapid growth and bioassay ưith tabacco tissue culturesỢ, Physiol Plant (15), pp. 473-479. 60.Newton R.J, Bloom J, Bivans D.H, Jain S.M (2001), ỘStable genetictransformation
of conifersỢ, Phytomorphology Golden Jubilee Issue, pp. 421Ờ434.
61.Parasharami V.A, Naik V. B, Arnold S, Nadgauda R.S and Clapham D.H (2006), ỘStable transformation of mature zygotic embryos and regeneration of transgenic plants of chir pine (Pinus roxbughii Sarg.) Plant Cell Rep (24),
pp. 708Ờ714.
62.Ai B.Z, Zheng J.W, Sheng J.T and Dian M.L (2003), ỘMonitoring the masson pine moth, Dendrolimus punctatus Walker (Lepidoptera: Lasiocampidae) with synthetic sex pheromone-baited traps in Qianshan County, ChinaỢ. Appl. Entomol. Zool, (38), pp. 177-186.
63.Nghia, N.H. (2004), ỘPinus merkusii Jungh et de Vriese. APFORGEN Priority Species Information Sheet. Published by the APFORGEN Secretariat, Kepong, Kuala Lumpur, Malaysia.
http://www.apforgen.org/apfCD/Information%20Sheet/APFORGEN-infosheet- Pinus.pdf.
64.Pullman G.S, Johnson S.G, Peter J and Cairney N.X (2003), ỘImproving loblolly pine somatic embryo maturation: comparison of somatic and zygotic embryo morphology, germination, and gene expressionỢ, Plant Cell Rep,
(21), pp.747Ờ758.
65.Sambrook J, Russell D.W (2001), ỘMolecular cloning. A Laboratory ManualỢ, 3rd
eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
66.Scott A.M and Jeffrey F.D (2000), ỘForest tree biotechnologyỢ, Elsevier Science,
(5), pp. 289-302. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
67.Smith J (1996), Growth medium, US Patent (15), pp. 1-25.
68.Tang W and Newton R.J (2003), ỘGenetic transformation of conifers and its application in forest biotechnologyỢ, Plant Cell Rep (22), pp. 1Ờ15.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ66
69.Tang W, Lin J and Newton J.R (2007), ỘOkadaic acid and trifluoperazine enhance
Agrobacterium-mediated transformation in eastern white pineỢ, Plant Cell rep, (26), pp. 673-682.
70.Tang W, Luo H and Newton J.R (2004), ỘEffects of antibiotics on the elimination of Agrobacterium tumefaciens from loblolly pine (Pinus taeda) zygotic
embryo explants and on transgenic plantregenerationỢ, Plant Cell, Tis and Org Cul (70), pp. 71Ờ81.
71.Tang W, Sederoff R and Whetten R (2001), ỘRegeneration of transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with
Agrobacterium tumefaciensỢ, Planta, (21) pp.981Ờ989.
72.Tere S, Jana M, Laurence G.N and Jan S (2005), ỘStable transformation of embryogenic tissues of Pinus nigra Arn. usinga biolistic methodỢ,
Biotechnology Letters (27), pp. 899Ờ903.
73.Tuija S.A, Teijo O.N and Hely M.H (2003), ỘThe production of transgenic Scots pine (Pinus sylvestris L.) via the application of transformed pollen in controlled crossingsỢ, Transgenic Research, (12), pp. 375Ờ378.
74.Walter C, Grace L.J, Wagner A, White D.W.R, Walden A.R, Donaldson S.S, Hinton H, Gardner R.C and Smith D.R (1998) ỘStable transformation and regeneration of transgenic plants of Pinus radiata D. DonỢ, Plant Cell Rep (17), pp. 460Ờ468.
75.Wenck A.R, Quinn M, Whetten R.W, Pullman G and Sederoff R (1999), ỘHigh- efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Norway spruce (Picea
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ67