3. nội dung địa điểm và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.4.Ph−ơng pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt
- Mẫu thịt gà mảnh đ−ợc lấy ở 3 vị trí: vết cắt, cơ l−ng, cơ l−ờn, cơ đùi. Vết cắt có độ dày 1-2cm. Trọng l−ợng mẫu từ 100 gr/mẫu.
- Mẫu lấy vào lúc 7 giờ sáng sau đó đ−ợc bảo quản ở 0- 40C rồi đ−a về phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt.
• Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí: Theo TCVN 5667-1992, Hà Nội (1992).
Lấy 25g thịt đã đ−ợc lọc bỏ mỡ, nghiền trong cối sứ rồi cho vào bình tam giác chứa 225 ml n−ớc sinh lý, ly tâm 2,5 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút. Ta có độ pha loãng ban đầu là 10-1, lắc đều, rồi tiếp tục pha loãng đến đậm độ thích hợp không còn khả năng d−ơng tính.
Lấy mỗi mẫu nuôi cấy 3 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch đến số vi khuẩn. Lấy 1ml dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri, rót vào 12-15 ml thạch 450, trộn đều thạch với dung dịch mẫu, để đông lại rồi cho vào tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ. Đọc kết quả rồi tính toán theo công thức sau:
1 2 a b c d vk / g F n x 1 n x 0,1 + + + Σ = +
∑CFU/g : Tổng số khuẩn lạc trong 1g mẫu a,b,c,d : Số l−ợng khuẩn lạc có trong 4 đĩa thạch n1 : Số đĩa thạch ở nồng độ pha loãng thấp; n2 : Số đĩa thạch ở nồng độ cao.
F : Hệ số pha loãng khi bắt đầu • Đếm chỉ số Coliforms và Feacal coliform:
Mẫu đ−ợc pha loãng ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3…
Dùng các ống nghiệm có chứa sẵn môi tr−ờng BGBL (Briliant Green Bile Lactose) có ống Durham úp ng−ợc, mỗi ống nghiệm cho vào 1ml mẫu pha loãng, dùng mỗi ống cho mỗi nồng độ pha loãng.
Sau đó đọc số ống sinh hơi lên men đ−ờng lactose. Ta có từng chỉ số ở mỗi nồng độ pha loãng. Dựa theo bảng MPN ta tính đ−ợc tổng số Coliforms và chỉ số Feacal coliforms.
• Ph−ơng pháp xác định số l−ợng vi khuẩn E.coli có trong thịt: Theo TCVN
5156-90, Hà Nội (1990).
Lấy 10g thịt gà đã bỏ mỡ nghiền trong cối sứ, rồi trong máy xay thịt, đổ vào 90ml dung dịch n−ớc thịt pepton ta thu đ−ợc dung dịch với độ pha loãng 10-1, ly tâm với vận tốc 10.000 vòng/phút. Sau đó pha loãng đến đậm độ thích hợp không còn khả năng d−ơng tính.
Lấy 1ml dung dịch pha loãng ở mỗi đậm độ cho vào đĩa petri, rót 12-15ml thạch Endo (mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch), lắc đều dung dịch mẫu và thạch). Để thạch đông, lật úp đĩa thạch để trong tủ ấm 370Ctrong vòng24-48 giờ rồi đọc kết quả. Khuẩn lạc E.coli trên môi tr−ờng Endo khuẩn lạc có màu hồng ánh kim, tròn, bờ đều. Chọn 5 điểm điển hình giám định bằng các phản ứng IMVIC, nếu đúng là E.coli thì:
- Phản ứng indol:d−ơng tính (I+) làm môi tr−ờng có màu đỏ;
- Phản ứng methyl red: d−ơng tính (M+) làm môi tr−ờng có màu đỏ;
- Phản ứng Voges - proskauer: âm tính (Vi-) không màu hoặc màu vàng; - Phản ứng Simmons -citrat: âm tính (C-).
• Ph−ơng pháp xác định số l−ợng vi khuẩn Staphylococus aureus: Theo
TCVN 5155-90, Hà Nội (1990).
- Lấy 10 gam thịt gà cho vào cối sứ nghiền nhuyễn, ly tâm với vận tốc 10.000 vòng/phút trong 2,5 phút. Cho vào 90ml môi tr−ờng BHI (canh thang Brain Heart Infusion) ta đ−ợc huyễn dịch có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng thành các đậm độ 10-2, 10-3,… đến khi không còn khả năng d−ơng tính.
- Lấy 1ml dịch pha loãng ở mỗi đậm độ cho vào đĩa petri rồi từ từ rót 12-15ml thạch Baird parker 450C vào, lắc đều, để cho thạch đông, lật úp đĩa thạch rồi cho vào tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó đọc rồi tính kết quả.
Khuẩn lạc Staphylococus aureus tròn, mặt nhẵn, viền mép gọn, có màu vàng đặc tr−ng.
- Giám định tính chất sinh hoá của Staphylococus aureus phân lập đ−ợc: Trên môi tr−ờng thạch Chapman: Cấy huyễn dịch trên vào hai đĩa môi tr−ờng, cho vào tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ rồi đọc kết quả.
Staphylococus aureus có khả năng phát triển trong điều kiện muối 7,5% và chuyển hoá đ−ờng mannit làm môi tr−ờng có màu vàng. Trong môi tr−ờng Chapman khuẩn lạc Staphylococus aureus tròn hơi đục, mặt nhẵn, viền mép gọn.
• Ph−ơng pháp xác định Salmonella trong thịt: Theo TCVN 5153-90, Hà Nội
(1990).
- Lấy 25 gam thịt gà đã lọc bỏ hết mỡ, gân nghiền nhuyễn, cho vào bình tam giác chứa 225ml n−ớc đệm pepton BPW 2% (Bufer Pepton Water 2%), cho vào máy li tâm tốc độ 10.000 vòng/phút quay trong 2 phút. Để tủ ấm 370C trong vòng 16-20 giờ.
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml canh trùng trên cho vào ống nghiệm có chứa 10ml môi tr−ờng selenit, ủ ấm 420C trong 48 giờ.
- Dùng que cấy vô trùng ria cấy canh trùng từ ống có chứa môi tr−ờng selenit lên 2 đĩa thạch SS và 2 đĩa thạch Brilliant green, sau đó nuôi trong tủ ấm 370C trong 48 giờ đối với các đĩa thạch SS và 24 giờ với các đĩa thạch xanh Brilliant.
Trên môi tr−ờng SS khuẩn lạc salmonella có chấm đen ở giữa vi sinh H2S. Trên môi tr−ờng thạch xanh Brilliant khuẩn lạc salmonella có mầu hồng vì không lên men đ−ờng lactoza và sacaroza.
- Những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella đều đ−ợc cấy chuyển vào các môi tr−ờng sinh hoá chẩn đoán và ống thạch th−ờng để xác định các tính chất sinh hoá:
Môi tr−ờng ODC (Orthinin Decacboxylaza) Môi tr−ờng mannit di động
Môi tr−ờng ure indol
Để tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ. Salmonella có các tính chất sinh hoá sau:
Các tính chất sinh hoá của Salmonella
Tính chất Kết quả % Glucoza +100 Lactoza -99,2 H2S -91,6 Hơi -91,6 Mannit +99,7 Di động +94,6 Ureaza +100 Indol -98,9 ODC +93 3.3.5 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập đ−ợc từ kết quả nghiên cứu, đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thông kê sinh học với công thức sau :
n xi X n i ∑ = = 1 xi : Số hạng thứ i X: Số trung bình n: Dung l−ợng mẫu Độ lệch chuẩn : sx = ( ) 1 1 2 − − ∑ = n X xi n i Sai số trung bình : =± (n>30 n Sx mx ) ; ( 30) 1 ≤ − ± = n n Sx mx