1.3.2.1 Các phương pháp chẩn đoán HPV[4]:
+ ELISA: nguyên lý của phương pháp này là kháng thểđược đánh dấu bằng cách gắn với enzym.
+ Kỹ thuật Western Blot: kỹ thuật này dựa trên nguyên lý của ELISA nhưng gián tiếp, trên màng nitroxenluloza để gắn kháng nguyên.
+ Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: kháng nguyên hoặc kháng thểđược
đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (ví dụ fluorescent)
- Phương pháp tế bào học: hình dạng tế bào bị tổn thương (Tế bào rỗng).
- Kính hiển vi điện tử: xác định cấu trúc của vi rút - PCR: xác định ADN của vi rút
- Nuôi cấy: không có ý nghĩa
Phương pháp huyết thanh học thường không thể xác định một cách đầy
đủ, còn kỹ thuật sinh học phân tử và đặc biệt là PCR và lai tại chỗ rất có giá trị trong chẩn đoán nhiễm HPV [1].
1.3.2.2 Phương pháp PCR và Real-time PCR: a. Nguyên lý của phản ứng PCR
- PCR (Polymerase chain reaction)- phản ứng tổng hợp dây truyền nhờ
men polymerase, do Kary Mullis phát minh năm 1985, là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sinh học phân tử.
- Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động của ADN polymerase, cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn. Như vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN, ta sẽ chỉ tổng hợp một đoạn ADN nằm giữa hai mồi.
- Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng
đoạn ADN riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao[14].
b.Đặc điểm phương pháp Real-time PCR
Phương pháp này sử dụng một thiết bị quang học để theo dõi quá trình khuếch đại bằng cách đo lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra. Những tín hiệu này được tạo ra từ những chất phát huỳnh quang gắn trên những mẫu dò được thiết kế để bắt cặp với những trình tự ADN cần khuếch đại. Tùy từng loại mẫu dò mà cơ chế phát huỳnh quang có sự khác nhau. Mẫu dò thường được sử dụng để phát hiện đột biến là Tapman probe (Có nhiều loại mẫu dò, nhưng mẫu dò hay sử dụng là Tapman probe ).
Taqman probe được gắn chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và chất “dập tắt” (quencher) huỳnh quang ở đầu 3’ sao cho ánh sang huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ bởi quencher. Mẫu dò HPV bắt cặp với trình tự
mục tiêu (mẫu dương tính - mẫu hoang dại) ở mỗi bước bắt cặp của phản ứng PCR, khi nó liên kết với trình tự mục tiêu, thiết bị Real-time PCR sẽ không đo lường tín hiệu huỳnh quang vì chất ức chếđó dập tắt tín hiệu phát ra. Ở bước kéo dài của PCR, hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt chất phát huỳnh quang ra khỏi chất ức chế, lúc này sẽ có tín hiệu huỳnh quang phát ra và được ghi nhận bởi thiết bị real-time PCR. Tín hiệu huỳnh quang chỉ
phát ra khi mẫu dò bắt cặp chính xác với vị trí mục tiêu trên đoạn sản phẩm khuếch đại để cho phép Taq polymerase cắt đi chất phát huỳnh quang.
Nếu mẫu âm tính (hay đột biến), Taq polymerase sẽ không gặp mẫu dò, chất phát huỳnh quang sẽ không bị tách khỏi chất ức chế và không có tín hiệu phát ra. Mẫu dò loại này có độđặc hiệu 100% và độ nhạy 97%.
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự
phân tích đầu cuối bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang [1].