2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:
- Nghiên cứu tiến cứu, mô tả từng trường hợp qua nghiên cứu lâm sàng và chụp cắt lớp vi tính và mô bệnh học u nhú mũi xoang, khảo sát sự liên quan giữa HPV và bệnh u nhú mũi xoang.
- Nghiên cứu mô tả lâm sàng có can thiệp đánh giá kết quả phương pháp phẫu thuật nội soi u nhú mũi xoang. Đề xuất quy trình phẫu thuật nội soi u nhú mũi xoang.
2.2.2 Phương pháp chọn mẫu:
- Chọn mẫu tiện lợi: chọn những bệnh nhân u nhú mũi xoang đến khám và điều trị tại Bệnh viện Tai Mũi Họng TƯ từ tháng 9/2009 đến tháng 2/2012.
2.2.3 Các nội dung nghiên cứu:
Mô tả các quy trình thao tác chuẩn cho các kỹ thuật sẽ được sử dụng trong nghiên cứu:
- Quy trình thông tin và khám sàng lọc đối tượng nghiên cứu:
+ Thông báo cho Khoa phòng khám Bệnh viện TMH TƯ thông tin vềđề
+ Phòng khám chuyên khoa: có thông báo cho bệnh nhân về nghiên cứu đang tiến hành, chọn bệnh nhân có khả năng nghiên cứu và những bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu thì sẽ được chọn vào nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
Bệnh nhân u hốc mũi
- Chẩn đoán lâm sàng (Khám nội soi)
- Chẩn đoán MBH (Nhuộm HE) - Chẩn đoán hình ảnh (CLVT)
Real-Time PCR
-Đánh giá kết quả
- Theo dõi tái phát
HPV (+) PTNS lấy u Bệnh phẩm UNMX Mục tiêu 1 HPV (-) Tìm 25 typ Tìm mối liên quan HPV & UNMX Không phát hiện AND HPV trong mô UNMX
Mục tiêu 2
Mục tiêu 3
RDB
Sơđồ 2.1 Mô hình nghiên cứu 2.2.3.1 Thực hiện mục tiêu 1:
- Bệnh nhân đến khám được hỏi bệnh, điền đầy đủ thông tin theo bệnh án mẫu (phụ lục 3).
- Chẩn đoán mô bệnh học được tiến hành theo các bước: + Lấy bệnh phẩm qua sinh thiết u nhú mũi xoang
+ Cốđịnh bệnh phẩm bằng Bouin + Khử nước bằng cồn ethylic + Khử cồn bằng dung dịch xylen + Tẩm paraffin để khử xylen + Đúc bloc nến paraffin + Cắt mảnh bệnh phẩm paraffin + Dán mảnh cắt bệnh phẩm trên phiến kính + Nhuộm Hématoxylin-Eosine + Đọc tiêu bản
+ Quy trình chẩn đoán được thực hiện ở Bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội và Khoa GPB Bệnh viện K.
+ Sử dụng phân loại u nhú mũi xoang của Tổ chức y tế thế giới (2005) gồm 3 loại: u nhú thường, u nhú đảo ngược và u nhú tế bào lớn ưa axit.
- Chụp cắt lớp vi tính mũi xoang tại Bệnh viện Tai Mũi Họng TƯ hoặc tại Khoa chẩn đoán hình ảnh-Bệnh viện Bạch Mai theo đúng tiêu chuẩn sau:
Thông số kỹ thuật Coronal Axial
Tư thế bệnh nhân Sấp hoặc ngửa Ngửa Góc chiếu Vuông góc cửa tai-
đuôi mắt
Song song cửa tai- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đuôi mắt
Độ dày lát cắt 2-4 mm 2-4 mm
Vùng cắt Bờ sau xương bướm- xương trán
Mào huyệt răng-
đỉnh xương trán - Phân giai đoạn u theo Krouse: gồm 4 giai đoạn
+ T 1: Khối u nằm trong hốc mũi chưa phát triển vào xoang, không có tổn thương ác tính
+ T 2: Khối u xâm lấn vào vùng phức hợp lỗ ngách và xoang sàng và/hoặc thành trong xoang hàm, không có tổn thương ác tính. + T 3: Khối u xâm lấn vào thành ngoài, dưới, trên, trước hoặc thành
sau xoang hàm, xoang bướm và/hoặc xoang trán, có hoặc không xâm lấn vào thành trong xoang hàm, xoang sàng hoặc hốc mũi. Không có tổn thương ác tính.
+ T 4: Xâm lấn vào các tổ chức xung quanh mũi xoang (ổ mắt, màng não, hố chân bướm hàm, tổ chức phần mềm của mũi hoặc mặt), hoặchoặc có tổn thương ác tính.
2.2.3.2 Thực hiện mục tiêu 2:
- Đánh giá vị trí xuất phát u và độ lan rộng của khối u để đưa ra chỉ định phẫu thuật nội soi phù hợp theo nguyên tắc phẫu thuật nội soi lấy UNMX: 4 giai đoạn
+ Bước 1: Lấy u trong hốc mũi
+ Bước 2: Lấy u ở khe giữa bao gồm cả phức hợp lỗ ngách + Bước 3: Cắt phần giữa xương hàm và lấy u trong xoang hàm + Bước 4: Lấy u trong xoang trán hay xoang bướm
- Chỉ định loại phẫu thuật:
+ Loại 1: bước 1 + phần niêm mạc xung quanh (cắt cuốn và hoặc lấy niêm mạc vách ngăn quanh chân bám khối u giữ nguyên màng sụn và sụn vách ngăn): khối u giai đoạn I
+ Loại 2: Bước 1 và 2 (mở rộng lỗ thông xoang hàm, mở sàng trước và ngách trán): khối u giai đoạn II.
+ Loại 3: Gồm cả 4 bước (PTNS tiệt căn + cắt phần giữa xương hàm): u giai đoạn III
- Bệnh nhân được phẫu thuật nội soi mũi xoang lấy u nhú có ghi hình các ca điển hình, đối chiếu vị trí xuất phát u và độ lan rộng u trong phẫu thuật và trước phẫu thuật.
- Phân tích các biến chứng trong, sau mổ và di chứng để đưa ra cách phòng tránh tai biến.
- Đánh giá kết quả sau PTNS:
+ Khám nội soi kiểm tra sau 1 tháng, đánh giá 3 mức độ
* Tốt: Hốc mổ sạch, niêm mạc phục hồi tốt * Trung bình: Hốc mổ viêm, chưa bít tắc PHLN
* Kém : Hốc mổ viêm, mủ nhầy, mủ, bít tắc PHLN, tái phát u. + Theo dõi tái phát:
* Khám nội soi định kỳ: 3 tháng/lần trong năm đầu 6 tháng/lần trong năm tiếp theo
* Khi nghi ngờ tái phát u: sinh thiết dưới nội soi, gửi làm mô bệnh học.
- U tái phát nhỏ: lấy bỏ u tái phát qua nội soi, gây tê tại chỗ.
- U tái phát to: chụp CLVT theo 2 tư thế Coronal, Axial; PTNS hoặc phối hợp PTNS và phẫu thuật đường ngoài.
- Theo dõi phát hiện tiến triển thành K biểu mô vảy (chẩn đoán xác
định dựa vào mô bệnh học).
2.2.3.3 Thực hiện mục tiêu 3: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lấy mẫu u nhú trước mổ hoặc trong phẫu thuật, mô sinh thiết dành cho nghiên cứu HPV được đựng trong các ống nhựa Eppendorf chứa PBS và kháng sinh, bảo quản ở -200 và gửi đến Bộ môn Y sinh học-Di truyền Trường
Đại học Y Hà Nội.
- Bộ môn Y sinh học-Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội tập hợp số
lượng mẫu để tiến hành xét nghiệm Real-Time PCR với cặp mồi MY11/MY09 và GP5+/GP6+ tìm ADN HPV, nếu kết quả dương tính sẽ tiếp tục xét nghiệm Reverse Dot Blot đểđịnh 25 týp gen HPV.
- Phân tích đối chiếu kết quả định týp HPV với lâm sàng và mô bệnh học để khảo sát mối liên quan giữa yếu tố nguy cơ HPV với u nhú mũi xoang.
2.2.3.4 Qui trình thực hiện xét nghiệm Real-Time PCR
a. Cặp mồi:
Chúng tôi sử dụng các oligonucleotide có trình tựđã công bố (Van Den Brule & cs, 2002) do công ty Integrated DNA Technologies (IDT - Hoa kỳ) tổng hợp được trình bày trong bảng dưới đây:
MY11 5' GCM CAG RGW CAT AAY AAT GG 3' MY09 5' CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC 3' GP5+ 5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3' GP6+ 5' GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C 3'
b. Qui trình Real-time PCR:
- Thành phần phản ứng RT-PCR
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (50mM KCl, Tris pH8 10mM). MgCl2. dNTP.
Thành phần của 1 phản ứng RT 20µl: Dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, M-MuLV Reverse Transcriptase 0.625 unit, MnCl2 1.5mM, mồi ngược 10pmol, RNA bản mẫu, nước cất vô trùng.
Thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR 25µl: Dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, mỗi mồi 10pmol, probe, DNA bản mẫu (hoặc cDNA), nước cất vô trùng.
- Phân tích kết quả:
Sau khi kết thúc quá trình realtime PCR, chuyển sang chế độ
“Analysis” để phân tích kết quả. DNA
Mồi xuôi và mồi ngược: MY11/09, GP5+/GP6+ Probe
Taq DNA polymerase Buffer 1X
dH2O
Phân tích chứng dương và âm: Chỉ chọn giếng chứng dương và âm, chọn màu FAM rồi đến màu HEX. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bước phân tích kết quả nếu:
+ Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính)
+ Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.
Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận “Mẫu dương tính”. Mẫu có
đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy vi rút trong mẫu”. Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể
dương hoặc âm. Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
Hình 2.3 Mẫu dưới ngưỡng phát hiện Hình 2.4 Mẫu âm tính
Mẫu nghiên cứu Chứng nội tại
2.2.3.5 Qui trình kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB):
a. Mẫu dò (probe): gồm có 25 mẫu dò đặc hiệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chúng tôi sử dụng các oligonucleotide có trình tựđã công bố (Van Den Brule & cs, 2002) do công ty Integrated DNA Technologies (IDT - Hoa kỳ) tổng hợp được trình bày trong bảng dưới đây:
HPV6 5' ATC CGT AAC TAC ATC TTC CAC ATA CAC CAA 3' HPV11 5' ATC TGT GTC TAA ATC TGC TAC ATA CAC TAA 3' HPV16 5' GTC ATT ATG TGC TGC CAT ATC TAC TTC AGA 3' HPV18 5' TGC TTC TAC ACA GTC TCC TGT ACC TGG GCA 3' HPV31 5' TGT TTG TGC TGC AAT TGC AAA CAG TGA TAC 3' HPV33 5' TTT ATG CAC ACA AGT AAC TAG TGA CAG TAC 3' HPV35 5' GTC TGT GTG TTC TGC TGT GTC TTC TAG TGA 3' HPV39 5' TCT ACC TCT ATA GAG TCT TCC ATA CCT TCT 3' HPV42 5' CTG CAA CAT CTG GTG ATA CAT ATA CAG CTG 3' HPV43 5'-TCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACATAT-3'
HPV45 5' ACA CAA AAT CCT GTG CCA AGT ACA T 3'
HPV51 5' AGC ACT GCC ACT GCT GCG GTT TCC CCA ACA 3' HPV52 5' TGC TGA GGT TAA AAA GGA AAG CAC ATA TAA 3'
HPV53 5’TGT CTA CAT ATA ATT CAA AGC 3’
HPV56 5' GTA CTG CTA CAG AAC AGT TAA GTA AAT ATG 3' HPV 57 5'-CCACTGTAACCACAGAAACTAATTATAAAG-3'
HPV58 5' ATT ATG CAC TGA AGT AAC TAA GGA AGG TAC 3' HPV59 5' TCT ACT ACT KCT TCT ATT CCT AAT GTA TAC 3' HPV61 5' TAC TGC TAC ATC CCC CCC TGT ATC TGA ATA 3' HPV66 5' TAT TAA TGC AGC TAA AAG CAC ATT AAC TAA 3' HPV68 5' TCT ACT ACT ACT GAA TCA GCT GTA CCA AT 3' HPV70 5'-CTGCCTGCACCGAAACGGCCATACCTGCTG-3' HPV71 5'-GTGCTACCAAAACTGTTGAGTCTACATATA-3' HPV81 5’GCT ACA TCT GCT GCT GC-3’ HPV82 5'-GCACTGCTGCTACTCCATCAGTTGCACAGA-3' b. Qui trình lai RDB Chuẩn bị màng lai:
• Ủ màng với dung dịch EDAC 16% (w/v) trong 10 phút ở nhiệt độ
phòng. Rửa màng lai với nước cất hai lần.
• Pha probe amino: 50-200pmol/µl trong dung dịch NaHCO3 0.5M- pH8.4, đặt lên màng để 10 phút. Đặt màng lai 10 phút trong 100ml dung dịch NaOH 0.1M, nhiệt độ phòng.
• Rửa màng lai 5 phút trong dung dịch SSPE 2X – SDS 0.1% ở 60oC.
• Rửa màng lai 15 phút trong dung dịch EDTA 0.02M, pH8, nhiệt độ
phòng (nếu sử dụng liền, ko cần bước này).
• Giữ màng lai ở 4oC trong bao nhựa cho đến khi sử dụng.
Lai và phát hiện: (Tùy kích cỡ màng lai, thể tích các dung dịch sẽ thay đổi):
• Biến tính sản phẩm PCR (DIG hoặc biotin) trong 5 phút với cùng một thể tích của dung dịch DB.
lý ở trên ở 42oC trong 60 phút.
• Sau khi lai, loại bỏ dung dịch lai, rửa màng lai 2 lần ở 42oC với dung dịch WB1 (đã ủở 42oC) trong 15 phút.
• Ủ màng lai ở 42oC với dung dịch WB1 (đã ủ ở 42oC) + 1% Streptavidine- Alkaline phosphatase trong 60 phút.
• Rửa màng lai với dung dịch WB2, 42oC trong 10’.
• Đặt màng lai vào dung dịch WB3, 2 lần ở nhiệt độ phòng trong 5’.
• Ủ màng lai với dung dịch SB + 2% NBT/BCIP trong 15-60’.
c. Phân tích kết quả RDB:
• Phân tích mẫu: Những tín hiệu dương tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp, những tín hiệu dương tính yếu phải lấy màng lai ra khỏi hộp và
đưa lên trước bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất. Tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm genotype đó, một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype. Những mẫu dương tính với các genotype có thể dương tính tại vị trí chứng dương hoặc không. Những mẫu âm tính với các genotype và dương tính tại vị trí chứng dương
được kết luận “Mẫu nhiễm HPV genotype khác ngoài 24 genotype của bộ kit
đang dùng”
• Tín hiệu tròn xanh dương tính có thể xanh đậm hoặc rất nhạt tương
ứng với mức độ nhiễm bệnh, tín hiệu này rất đặc trưng, nằm ngay tại vị trí tương ứng với genotype và có thể nhìn thấy rõ ràng từ cả 2 mặt của màng lai. Những vệt xanh không đặc hiệu thường không nằm tại các vị trí tương ứng với các genotype và chỉ nhìn thấy từ mặt trên của màng lai.
• In hình kết quả: Chụp hình màng lai của mỗi mẫu và lưu lại thành file trên máy vi tính. Chèn hình vào trang trả kết quả, chú thích các vị trí “Chứng dương”, “Các genotype dương tính”. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.5 Sơđồ các vị trí genotype trên màng lai
Mẫu dương tính các genotype với chứng dương dương tính hoặc không
2.2.3.6 Qui trình thực hiện phẫu thuật nội soi cắt u nhú mũi xoang:
- Lấy bỏ phần u trong hốc mũi bằng dụng cụ cắt hút cho đến khi quan sát rõ chân bám khối u. Cần thận trọng tránh giật trực tiếp u ra khỏi tổ chức liên quan trong hốc mũi hoặc niêm mạc mũi xoang.
- Nếu khối u khu trú ở cuốn giữa hoặc cuốn trên thì tiến hành cắt cả
cuốn thành khối.
- Nếu khối u xuất phát từ vách mũi xoang hoặc xoang sàng thì sử dụng dao lưỡi liềm hoặc bay bóc tách rạch niêm mạc quanh u lấy đến vùng rìa niêm mạc lành.
- Nếu khối u xuất phát từ xoang hàm: mở rộng lỗ thông xoang hàm để
quan sát được xoang hàm, sử dụng troca chọc qua hố nanh. Đưa dụng cụ cắt hút qua hố nanh vào trong xoang hàm và lấy u dưới quan sát của nội soi, sau
đó đưa ống nội soi qua lỗở hố nanh để quan sát vị trí xuất phát u.
- Nếu khối u xuất phát từ thành sau xoang hàm, sử dụng dụng cụ cắt hút lấy u qua chỗ mở khe giữa rộng dưới sự quan sát của nội soi đưa qua lỗ đục ở hố nanh. Đường đưa ống nội soi và dụng cụ cắt hút có thể hoán đổi luân phiên cho đến khi lấy hết u và tổ chức niêm mạc vùng rìa xung quanh u.
- Nếu khối u xuất phát từ sàn hoặc thành ngoài, trong hay thành trước xoang hàm cần phẫu thuật nội soi cắt phần giữa xương hàm.
- Phẫu thuật nội soi cắt phần giữa xương hàm:
hàm đến khi quan sát được lỗ thông mũi xoang (Hình 2.6)
Hình 2.6: Dùng dụng cụ cắt hút lấy u trong hốc mũi [208]
+ Tiến hành rạch trên chỗ chân bám cuốn giữa để lật vạt niêm mạc bộc lộ ngách trán và xoang hàm.
+ Rạch từ chỗ bám của cuốn giữa và vách mũi xoang ngang qua vùng xương lệ và tiến vào ngách trán của xương hàm, phía trước tiến sát cuốn dưới,
đường rạch tiếp tục dọc theo chỗ ranh giới của vách mũi xoang và sàn mũi, ra phía sau của đuôi cuốn dưới, tiến vào phía sau của vách xoang hàm (Hình 2.7)