PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. đỐI TƯỢNG
Các nông hộ, trang trại chăn nuôi gà, các ựiểm kinh doanh thuốc thú y và thịt gà ựược bán tại một số chợ ở Hải Phòng
3.2. NỘI DUNG
Trong ựề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
3.2.1. Tỉnh hình phát triển chăn nuôi ở Hải Phòng
- Các phương thức chăn nuôi hiện ựang ựược áp dụng tại Hải Phòng - Tình hình phát triển ựàn gia cầm của tỉnh Hải Phòng.
3.2.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà ở Hải Phòng
- Một số ựặc ựiểm kinh doanh thuốc thú y trên ựịa bàn Hải Phòng - Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm ở Hải Phòng
3.2.3. Kết quả phân tắch mẫu thịt gà ựược lấy tại các chợ ở Hải Phòng
- Kết quả phân tắch sàng lọc
- Kết quả phân tắch ựặc hiệu ựịnh nhóm tetracyclin và (fluoro)quinolon - Kết quả phân tắch khẳng ựịnh nhận diện và ựịnh lượng tồn dư nhóm
tetracycline, (fluoro)quinolon và chloramphenicol trong thịt gà.
3.3. NGUYÊN LIỆU
+ Mẫu ỘtrắngỢ sử dụng trong nghiên cứu này là mẫu thịt gà ựược nuôi hoàn toàn bằng thóc và ngô chắc chắn không chứa kháng sinh trong hai tháng. + Hóa chất môi trường và chủng vi sinh vật (VSV) dùng ựể sàng lọc kháng sinh (chi tiết ở phần 3.3.1).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 26 + Kắt phân tắch ựặc hiệu dùng ựể ựịnh nhóm (Tetrasensorệ ựể phát hiện tetracycline và ELISA ựể phát hiện nhóm (fluoro)quinolon (chi tiết ở phần 3.3.2).
3.3.1. Dụng cụ và nguyên vật liệu dùng ựể sàng lọc kháng sinh (screening) (screening)
+ Các dụng cụ, thiết bị cần thiết dùng trong phân tắch và nuôi cấy VSV. + Hệ thống bay hơi bằng khắ Nitơ, ựĩa Petri vô trùng (ựường kắnh 90 mm), ựĩa giấy (Roth, Art. KA 10.1) ựường kắnh 12,7 mm.
* Hoá chất: Glucose, NH4OH 2M, HCL 1M, NaOH 1%, Methanol, hỗn hợp Acetonitrile/Acetone (70/30 v/v), Trimethoprim (TMP), PABA (para Ờ aminobenzoic acid)
* Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis BGA dạng huyền phù 107 spores/ml (Merck, 1.10649, Damstadt, Germany).
* Môi trường nuôi cấy: Agar test for inhibition test pH6 (Merck,
1.10663, Damstadt, Germany) và Standard II Nuitrient Agar for microbiology pH 7,5 (Meck 1.07883, Damstadt, Germany). Môi trường ựược chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau khi thêm ựường Glucose với tỷ lệ 0,6%. Mỗi ựĩa Petri ựược láng 8ml môi trường ựã ựược trộn B. subtilis với tỷ lệ 0,1%. Cân 25g môi trường và 6g ựường Glucose hoà tan vào 1 lắt nước cất, ựun sôi và khuấy ựều liên tục. Sau ựó chia ra các bình tam giác nhỏ, ựem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, ựể nguội tới nhiệt ựộ 40 Ờ 45oC. Trộn dung dịch giống vi khuẩn vào theo tỉ lệ 100ộl B.subtilis BGA dạng huyền phù vào 100ml môi trường, lắc ựều. Hút 8ml môi trường ựã trộn VSV vào ựĩa Petri. Sau khi thạch ựể ựông cứng ựược bao gói và bảo quản ở 4oC tối ựa 1 tuần.
* Qui trình tách chiết kháng sinh từ mẫu thịt
Qui trình tách chiết ựược thắch ứng từ phương pháp Premi-Test (Stead và cs., 2004; Dang và cs, 2011). Kháng sinh trong mẫu ựược tách chiết từ 12
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 27 gam thịt gà trong hỗn hợp Acetonitrile/Acetone (70/30 v/v). Các mẫu tách chiết ựược lắc ựảo ựầu trong 10 phút, sau ựó ựược ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15ồC. Lớp trên ựược cho vào hai ống nghiệm thủy tinh khác nhau (ống thứ nhất chứa 115 ộl và ống thứ hai chứa 285 ộl), sau ựó làm bay hơi ựến khô. Phần chất khô còn lại trong hai ống sau khi bay hơi ựược thu hồi trong 115ộl nước cất ựối với ống thứ nhất và 285ộl methanol ựối với ống thứ hai. Phần tách chiết tiếp tục ựược ly tâm như trên và 50 ộl lớp trên trong mỗi ống ựược nhỏ lên một ựĩa giấy ựể phân tắch khả năng ức chế trên hai môi trường pH6 và pH7,5 (Sơ ựồ 1).
Sơ ựồ 3.1. Sơ ựồ ựặt ựĩa phương pháp hai ựĩa mới (Dang và cs, 2011)
S S+Na S+ S+ TMP S+TMP +PABA đĩa 1 đĩa 2 đĩa 6 đĩa 7 Sw Sw +Na đĩa 3 đĩa 4 S+Na đĩa 5