Ch−ơng 2 :Đối t−ợng, Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
2.4.9. Ph−ơng pháp xác định độc tố và yếu tố bám dính của vi khuẩn Ẹ coli bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
Các chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập đ−ợc từ lợn mắc bệnh phù đầu, sau khi xác định là Ẹ coli bằng các phản ứng sinh hóa, đ−ợc tiếp tục xác định các gen m; hóa các loại độc tố và kháng nguyên bám dính bằng ký thuật PCR.
* Ph−ơng pháp tiến hành:
- DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn Ẹ coli mọc trên môi tr−ờng thạch máu ở 37oC/24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR:
Primers : 1àl mỗi loại
Dung dịch đệm (5X) : 5.0àl Enzyme (Taq polymerase): 0.05àl
N−ớc khử ion vừa đủ để đạt đ−ợc thể tích cuối cùng là 25àl cho 1 phản ứng. - Chu trình của một phản ứng PCR:
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 b−ớc và đ−ợc thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo sơ đồ sau:
Chu trình thứ
nhất
Chu trình tiếp theo
Chu trình
cuối Loại yếu tố gây
bệnh cần xác định Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) STa, STb, LT, VT2e 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 F4 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 F18 94/5 94/0,5 50/0,5 72/0,5 72/7
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 43
- Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu đ−ợc sau chu trình phản ứng đ−ợc nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), đ−ợc trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR đ−ợc chạy điện di trên thạch agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp.
Ph−ơng pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi tr−ờng pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện tr−ờng, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực d−ơng. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo các kích th−ớc sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại kích th−ớc phân tử lớn chạy chậm, loại có kích th−ớc bé thì chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm:
Gel thạch sau khi chạy điện di đ−ợc nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (1àl/ml) trong vòng 15 phút. Để quan sát sản phẩm PCR, DNA mẫu cần phải đ−ợc nhuộm bằng ethidium bromide (BEt) d−ới đèn tử ngoạị BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một l−ợng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự dọ BEt có thể sử dụng bằng cách trộn với mẫu, cho vào đệm điện di (0,5àl/ml), cho vào thạch (0,5àl/ml) hoặc nhuộm sau khi điện di xong (1àl/ml) .
- Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát d−ới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camerạ Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 44
hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh đ−ợc và ghi nhận lạị Kích th−ớc các băng DNA đ−ợc so sánh với DNA chuẩn (DNA marker) (giếng M), đ−ợc cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt, cạnh các lỗ dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà ng−ời ta có thể xác định đ−ợc độ dài của đoạn sản phẩm PCR.