3. đỊA đIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.11. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA ựược sử dụng dùng ựể ựánh giá chất lượng kháng huyết thanh là phương pháp bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA = Plate Trapped Antigen Ờ ELISA
) (Mowat & Dawson, 1987. Các bước của một kỹ thuật PTA-ELISA chuẩn như sau:
Bước 1: Cố ựịnh dịch cây cần kiểm tra
- Nghiền 0,1 g mẫu lá cây cần kiểm tra trong ựêm carbonate với tỉ lệ lá/dung dịch ựệm từ 1/5 Ờ 1/30 (khối lượng/thể tắch).
- Ly tâm 13000 vòng/phút, thu lấy dịch trên tủạ
- Nhỏ dịch mẫu vào bản ELISA: 100 ộl /giếng. để bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua ựêm trong tủ lạnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 24 cất. Mỗi lần rửa cách nhau 1 phút.
Bước 2: Cố ựịnh kháng thể thỏ ựặc hiệu virus
- Nghiền mẫu lá cây khoẻ trong dung dịch ựệm kháng huyết thanh (PBS-T +2% Ovalbumin). Li tâm 10000g trong 15 phút và thu dịch trên tủạ
- Cho kháng huyết thanh vào dịch cây khoẻ theo tỷ lệ 1/100 Ờ 1/1000, trộn ựều và ủ ở 37oC trong 45 phút ựể hấp thụ chéo các kháng thể không ựặc hiệu có trong kháng huyết thanh (kháng thể không ựặc hiệu là kháng thể phản ứng với protein của cây).
- Nhỏ vào mỗi giếng 100 ộl dịch cây khoẻ chứa kháng huyết thanh ở trên. Sau ựó ựể bản ELISA trong hộp ẩm và ựể trong ựiều kiện nhiệt ựộ 37oC trong thời gian 2 Ờ 4 giờ.
- Rửa bản ELISA (như ở bước 1)
Bước 3: Cố ựịnh kháng thể chuột liên kết AP (Alkaline phosphatase) ựặc hiệu kháng thể thỏ.
- Pha kháng thể chuột liên kết AP ựặc hiệu kháng thể thỏ trong ựệm kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1/5000.
- Nhỏ vào mỗi giếng 100 ộl dịch kháng thể chuột ở trên. - để bản ELISA trong hộp ẩm và ủ ở 37oC trong 2-4 giờ. - Rửa bản ELISA (như ở bước 1)
Bước 4: Cố ựịnh chất nền (nitrophenyl photphat)
- Pha chất nền trong ựệm cơ chất với lượng 1 mg/mL - Nhỏ 100 ộl dịch chất nền vào mỗi giếng
- để bản ELISA ở nhiệt ựộ phòng, trong tối, trong 30-60 phút
- đánh giá kết quả bằng mắt và ựo mật ựộ quang OD (optical density) bằng máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 25