2 Mẫu rầy xanh ựuôi ựen 0.440 3 Mẫu rầy xanh ựuôi ựen 0
4.3.1.Nhân gen virus bằng RT-PCR
để nhân gen virus RYSV, chúng tôi sử dụng 2 mẫu lúa bị bệnh vàng lá ựều ựược thu thập tại ruộng bị bệnh vàng lá ựiển hình của xã Hòa Sơn Ờ Hiệp Hòa Ờ Bắc Giang. Mẫu thứ nhất là mẫu 1075 thu vụ mùa năm 2010. Mẫu này ựã ựược xác ựịnh trình tự trực tiếp và bảo quản khô. Mẫu thứ hai là mẫu lúa bị bệnh thu vụ xuân năm 2011.
RNA tổng số của 2 mẫu này và một mẫu ựối chứng ựược chiết bằng kit TriPure (Roche).
đầu tiên, chúng tôi nhân ựoạn gen bằng cặp mồi RY-N-F1 và RY-L-R2. Do kắch thước sản phẩm rất lớn ~ 11 kb (Hình 4.16) nên phản ứng RT-PCR ựã ựược thực hiện theo 2 bước với các kắt thương mại chuyên áp dụng cho tổng hợp sản phẩm lớn. Bước 1 (tổng hợp sợi cDNA) ựược thực hiện với kit RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas) và bằng mồi RY-L-R2. Bước 2 (phản ứng PCR) ựược thực hiện với kit Expand Long Template PCR System (hãng Roche) và bằng cặp mồi RY-N-F1 /RY-L-R2 và khuôn cDNA ở bước 1. Tuy nhiên, phản ứng PCR ựã không tạo băng sản phẩm, có lẽ do kắch thước quá lớn của chúng (Bảng 4.17).
Tiếp theo, sử dụng khuôn cDNA tổng hợp từ bước 1 ở trên, chúng tôi ựã dùng PCR với kit DreamTaq (hãng Fermentas) ựể nhân 2 sản phẩm nhỏ (với kắch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 54 thước > 400 bp dùng 2 cặp mồi RY-N-F1 & RY-N-R1 và RY-L-F2 & RY-L-R2. Kết quả PCR ựã cho thấy băng ựặc hiệu hình thành từ mẫu 1075 thu năm 2010 mà không hình thành từ mẫu thu năm 2011 (Bảng 4.17 và Hình 4.17). Dựa trên kết quả này, chúng tôi chọn sản phẩm RT-PCR của mẫu 1075 cho các nghiên cứu tiếp theọ
Bảng 4.17. RT-PCR nhân dòng 3 sản phẩm gen RYSV RT-PCR
Mẫu Mã RY-N-F1 & RY-
L-R2
RY-N-F1 & RY- N-R1
RY-L-F2 & RY-L- R2
1 1075 Không có 444 bp 422 bp
2 2011 Không có Nhiều băng không ựặc hiệu
Nhiều băng không ựặc hiệu 3 Lúa khỏe Không có Không thử Không thử
Hình 4.17. RT-PCR dùng 2 tổ hợp mồi ựể nhân gen L và N của RYSV từ 2 mẫu lúa bệnh 1075 và 2011. M là thang DNA 1 kb (Fermentas) với băng tham
khảo 0.5 kb ựược chỉ bằng mũi tên.