3. đỊA đIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.5. Phản ứng RT Ờ PCR
Hai cặp mồi ựặc hiệu gen N và L của RYSV (Rice yellow stunt virus) ựã ựược thiết kế từ bộ gen ựầy ựủ của RYSV sẵn có trên Ngân hàng gen (mã số truy cập AB011257). Cặp mồi thứ nhất ựặc hiệu gen N (RY-N-F1 và RY-N-R1) tạo sản phẩm có kắch thước 444 bp còn cặp mồi thứ 2 ựặc hiệu gen L (RY-L-F2/RY-L-R2) tạo sản phẩm 422 bp. Trình tự các mồi này là:
RY-N-F1 GCCAGTGCAGATGCCTTATTAGTC RY-N-R1 GGTCTCTGCCTCTGTCATTCGTTC RY-L-F2 AGGTACCAAGACGGCTCAACTATG RY-L-R2 AAGGTGGGGAAGGTCGGAATC Phản ứng RT-PCR ựược thực hiện theo 2 cách
Ớ RT-PCR 1 bước: Kết hợp cả bước tổng hợp cDNA và PCR, dùng kắt
Ớ RT-PCR 2 bước: ựầu tiên, RNA của virus ựược chuyển thành cDNẠ Tiếp theo, cDNA ựược dùng làm khuôn ựể chạy PCR
RT-PCR 1 bước: Phản ứng RT-PCR ựược thực hiện với 2 enzyme Reverse Aid và Dreamtaq của hãng Fermentas. Phản ứng ựược thực hiện trong tube Effpendorf 0.5 ml chứa các thành phần sau: Tên Lượng (ộl) H2O 15.6 đệm DreamTaq (x10) 2.0 dNTPs 0.3 Mồi xuôi dòng 0.3 Mồi ngược dòng 0.3 ReverseAid 0.2 Dream Taq 0.3 RNA 1 Tổng thể tắch 20
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 20 Phản ứng RT Ờ PCR 1 bước ựược thực hiện theo các ựiều kiện sau:
- Tổng hợp sợi cDNA trong 30 giây ở 45 OC - Khởi ựầu biến tắnh 4 phút ở 94 OC
- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 OC trong 35 giây; 54 OC trong 35 giây; 72 OC trong 1 phút
- Cuối cùng là bước kết thúc ở 72 OC trong 5 phút.
RT-PCR 2 bước
Bước 1 (tổng hợp cDNA) ựược thực hiện với kit RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas) và bằng mồi RY-L-R2. Phản ứng ựược thực hiện theo hươnga dẫn của nhà sản xuất với nhiệt ựộ tổng hợp là 50 oC và thời gian 60 phút.
Bước 2 (phản ứng PCR) ựược thực hiện với khuôn cDNA ở bước 1 với kit Expand Long Template PCR System (hãng Roche) dùng 3 tổ hợp mồi: (i) RY-N-F1/RY- L-R2, (ii) RY-N-F1/RY-N-R1, và (iii) RY-L-F2/RY-L-R2. Phản ứng PCR ựược thực hiện với enzyme Dreamtaq hoặc hoặc dùng kit Expand Long Template PCR System. Phản ứng ựược thực hiện trong tube Effpendorf 0.5 ml chứa các thành phần sau:
Tên Lượng (ộl) H2O 21.3 đệm phản ứng (x10) 2.5 dNTPs 0.3 Mồi xuôi dòng 0.3 Mồi ngược dòng 0.3
Dream Taq hoặc Enzyme mix (kit Expand) 0.3
cDNA 1
Tổng thể tắch 25
Phản ứng PCR ở bước 2 ựược thực hiện theo các ựiều kiện sau: - Khởi ựầu biến tắnh 4 phút ở 94 OC
- Tiến hành 35 chu kỳ phản ứng ở 94 OC trong 35 giây; 54 OC trong 35 giây; 72 OC trong 1 (hoặc 10) phút tùy tổ hợp mồị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 21