3. đỊA đIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.9. Tinh chiết phân tử virus RYS
Qui trình chiết phân tử RYSV từ lúa ựược thực hiện theo qui trình chiết virus Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) trên cỏ Bermuda (Lockhart et al.,1985). Các bước cụ thể như sau:
Ớ Nghiền mẫu bệnh: Khoảng 100 g mô lá lúa nhiễm RYSV (ựã ựược kiểm tra RT-PCR) ựược nghiền với 400 mL ựệm citrate (sodium citrate) 0.1 M, pH 6.5 chứa 10 % ựường sucrose, 0.2 % Na2SO3 và 4 % bột than hoạt tắnh. Mô lá ựược nghiền trong ựệm lạnh bằng máy nghiền sinh tố. Lọc dịch nghiền bằng vải lọc.
Ớ Acid hóa dịch nghiền: Sau khi lọc dịch nghiền qua vải lọc, dịch ựược acid hóa tới pH 0.5 bằng nhỏ từ giọt acid acetic ựậm ựặc (acid acetic băng). Dịch ựược giữ ở 4 OC trong 2 Ờ 4 giờ.
Ớ Làm trong: Dịch ựược làm trong bằng ly tâm ở 17400 g trong 20 phút bằng máy ly tâm Beckman Algera 64G. Lấy dịch trong và loại bỏ cặn.
Ớ Sa lắng virus: Sa lắng virus trong dịch trong ở trên bằng siêu ly tâm ở 91500 g trong 30 phút (máy siêu ly tâm Beckman Optima L-90K). Hòa cặn virus trong ựệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 10 % ựường sucrose và 0.85 % NaCl.
Ớ Tách virus bằng ly tâm gradient tỷ trọng. Dịch virus ở trên ựược tách bằng ly tâm trên nệm gradient tỷ trọng ựường sucrore (12-50%). Nệm tỷ trọng ựược chuẩn bị với ựệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. Nệm tỷ trọng ựược ly tâm ở 107000 g trong 45 phút.
Ớ Thu thập vùng chứa virus bằng xi ranh y tế.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23 Hòa cặn virus tinh chiết trong 1 mL ựệm phosphate 0.01 M, pH 7.2 chứa 0.85 % NaCl. đây là dịch virus ựã tinh chiết. Kiểm tra dịch virus tinh chiết bằng RT-PCR và bảo quản ở - 20 O C.