9 11-18 Khang Dân Cây bình thường, lá biến vàng ựỏ 18/05 Bắc Giang 10 11-20 Nhị ưu 838 Cây lùn, lá biến vàng ựỏ 11/05 Hòa Bình
4.2.3. Tinh chiết phân tử virus
Virus RYSV là một virus có vỏ bọc cấu tạo bởi một lớp màng phospholipid có nguồn gốc từ tế bào ký chủ. Phẩn có hoạt tắnh kháng nguyên là các gai vỏ glycoprotein trên bề mặt tế bàọ Do bản chất lớp vỏ rất không bền vững với dung môi nên qui trình tinh chiết phân tử virus RYSV (và các virus có vỏ bọc khác) khá khác biệt và không dùng dung môi trong quá trình chiết.
Qui trình tinh chiết virus RYSV ựược chúng tôi thực hiện theo phương pháp chiết một nucleorhabdovirus là Cynodon chlorotic streak virus (CCSV) từ cây cỏ Bermuda (Lockhart et al.,1985). Các bước cụ thể ựược trình bày chi tiết trong phần vật liệu và phương pháp nhưng có thể tóm tắt theo bảng 4.5.
Từ 100 g mô lá bệnh, qua quá trình tinh chiết, chúng tôi thu ựược 2 mL dịch virus dùng ựể tạo kháng huyết thanh. để kiểm tra sự có mặt của virus RYSV trong mẫu tinh chiết, chúng tôi ựã kiểm tra trực tiếp 1ộL dịch virus bằng RT-PCR dùng mồi RY-L-F2/RY-L-R2. Kết quả phản ứng dương tắnh. Mặc dù phản ứng RT-PCR không ựảm bảo chất lượng và ựộ tinh khiết của mẫu virus nhưng chúng tôi vẫn tiến hành sử dụng mẫu này ựể tạo kháng huyết thanh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Bảng 4.5. Tóm tắt các bước tinh chiết phân tử virus RYSV từ mô lá lúa bệnh
TT Bước Nội dung
Lượng dịch (mL)
1 Công phá mô và tế bào
Nghiền mô lá trong ựệm citrate natri, pH 6.5 chứa ựường sucrose, Na2SO3 và bột than hoạt tắnh. Lọc dịch nghiền bằng vải lọc.
400
2 Acid hóa dịch nghiền
Dịch nghiền ựược acid hóa tới pH 0.5 bằng acid
acetic và giữ ở 4 OC trong 2 Ờ 4 giờ. 400
3 Làm trong Dịch nghiền acid hóa ựược làm trong bằng ly tâm
ở ở tốc ựộ thấp. Lấy dịch trong. 450
4 Kết tủa virus
Ly tâm dịch ở trên bằng siêu ly tâm (~100000 g/30 phút). Hòa cặn virus trong ựệm phosphate chứa ựường và NaCl.
20
5 Tách virus bằng gradient
Dịch virus ựược tách hơn nữa bằng ly tâm
gradient tỷ trọng ựường sucrore và hòa trong ựệm 2